用一恒LRH-250对酸菌的分离纯化

1 材料与方法 

1.1 材料与仪器 

山西老陈醋醋醅 山西老陈醋集团有限公司定 州分公司; DNA Marker 北京桥生物科技有限公司; dNTPs 日本 TAKAＲA 公司; TransTaq  － T DNA Polymerase 北 京 全 式 金 生 物 技 术 有 限 公 司; 引 物 由北京奥科鼎盛公司合; 草酸、酒石酸、丙酮酸、 乙酸、乳酸、α－ 酮戊二酸( 标准品) 、2－辛醇( 分析 纯) Sigma－Aldrich公司。 JY2002 电子天平 上海浦春计量仪器有限公 司; PHS－ 3CpH 计 上海精密科学仪器有限公司; LＲH－250 恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公 司; DL－CJ－2ND I 超净工作台 北京东联哈尔仪器 制造有限公司; TENSUC 恒温摇床 上海天呈实验仪 器制造有限公司; YQX－ SG46 －280S 高压蒸汽灭菌 器 上海博迅实业有限公司医疗设备厂; 高效液相 色谱仪 美国安捷伦公司; 气相色谱质谱仪 美国赛默飞世尔科技公司。

1.2 实验方法

醋酸菌、芽孢杆菌发酵培养基: 葡 萄糖 10 g /L，酵母粉 10 g /L，蛋白胨 3 g /L，121 ℃灭菌 20 min，降温至 55 ℃左右加入无水乙醇 5% ( V/V) 。 产酸菌株筛选培养基( GYC 培养基) : 葡萄糖 10 g /L，酵母浸粉 10 g /L，胰蛋白胨 3 g /L，轻质碳酸 钙 5 g /L，琼 脂 粉 20 g /L，115 ℃ 高 压 蒸 汽 灭 菌 30 min。斜面 保 藏 培 养 基: 胰 蛋 白 胨 10 g /L，酵 母 粉 5 g /L，NaCl 5 g /L，琼脂 20 g /L，121 ℃高压蒸汽灭菌 20 min 乳酸菌发酵培养基( MＲS) : 葡萄糖 20 g /L，酵 母粉 5 g /L，蛋白胨 10 g /L，KH2PO4 1 g /L，K2HPO4 2.5 g /L，MgSO4 1 g /L，NaCl 2.5 g /L，115 ℃ 灭 菌 30 min，降温至 55 ℃左右加入无水乙醇 5% ( V/V) 。

1.3 数据处理 

每组实验进行三个平行，样品中挥发性成分的 定性通过与 Nist 数据库进行分析比较，检测出挥发 性成分匹配度大于 800 的化合物，采用内标法定量 方式求得各组分含量; 利用 Excel 2007 软件处理试验 数据。

2 结果与分析

发酵 结束后，将发酵液于 10000 r/min 离心 10 min。上清 液用 0.22 μm 滤膜过滤除杂质，利用 HPLC 测定其中 的各种有机酸含量。首先对草酸、酒石酸、丙酮酸、 α－酮戊二酸、乳酸、乙酸、富马酸、琥珀酸等 8 中有机 酸进行 HPLC 检测，然后通过产酸菌发酵液与标准品 保留时间的比对，通过外标法对其进行定量。并 且 产 乙 酸 的 含 量 达 到 4885.25 mg /100 mL，与杜宏福等在研究山西老陈醋 整个发酵过程细菌群落组成和有机酸变化规律中，在 醋酸发酵阶段产生的 3916.3 mg /100 g 醋醅相比，具有 较高产乙酸水平。短乳杆菌 BCP0738 能够同时产乙 酸和乳酸，其含量分别为 648.58 和 395.07 mg /100 mL。 赵国忠等［在老陈醋酿造过程酒精发酵阶段添加一 株优良 乳 酸 菌，发 酵 终 期 检 测 到 乳 酸 的 含 量 为 62 mg /100 mL。刘阳等从保宁醋醋曲中分离得到 1 株发酵乳酸杆菌( Lactobacillus femertum) ，检测到乳 酸、乙酸，含量分别为 66.56 和 104.08 mg /100 mL。芽 孢杆菌 BCP0449 能够产生两种有机酸，分别为乙酸和 琥珀酸，总量为 2108.24 mg /100 mL，两种有机酸产量 高于于华等从四川麸醋醋醅中筛选出的产酸芽孢 杆菌，其产乙酸和琥珀酸的总量为 9.85 mg /100 mL。

3 结论 

从山西老陈醋醋醅中筛选得到了 3 株不同 产酸菌，分别为巴氏醋杆菌( Acetobactor pasteurianus) BCP0454、短乳杆菌( Lactobacillus brevis) BCP0738 和 枯草芽孢杆菌( Bacillus subtilis) BCP0449，其发酵产 物中含有影响山西老陈醋风味及品质的功能成分。 通过所产有机酸和风味物质两方面对单菌功能特性 进行探究，分别得 BCP0454 具有较好产有机酸的能 力，并且所产乙酸含量( 4885.25 mg /100 mL) 相对较。

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