白念珠菌生物膜形成的抑制作用

白念珠菌（Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）是一种常见的条 件致病真菌，平时定植于人体的皮肤、口 腔、胃 肠 道及阴道等部位，当机体抵抗力降低或菌群失调时， 白念珠菌会过度增殖，引起上述部位的。有 研究表明，医院内条件性真菌感染中７８％～８０％是 由该菌引起。

１ 材料

１．１ 药物与菌株

①白念珠菌（Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ） 标准株ＳＣ５３１４：由海军军医大学药学院姜远英教授 惠赠。②桑黄：由安徽医科大学药学院李宁教授实 验室提供。③ＢＡＥＰ制备：取桑黄子实体粉适量，加 ８倍７０％甲醇回流提取３次，每次２ｈ，合并滤液，真 空回收溶剂，得浓缩物，浓缩物水分散后，依次用１０ 倍容积石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取５次，真空挥 干溶剂，分别得到桑黄石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和 水４部分 提 取 物。④阳性对照药物为氟康唑（ｆｌｕ－ ｃｏｎａｚｏｌｅ，ＦＬＺ）（批号 Ｊ０９Ｍ６Ｂ１）：由上 海 源 叶 生 物 科技有限公司提供。

１．２ 试剂 及 材 料

ＸＴＴ 粉（批号 Ｆ５２３ＢＡ００１２）： 加拿大 ＢＢＩ公司；荧 光 素 二 乙 酸 酯（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｄｉ－ ａｃｅｔａｔｅ，ＦＤＡ）（批号 Ｆ１６５５１）：上海翊圣科技有限公 司；２５％ 戊 二 醛 （批 号 ０７１５Ａ１９）、ＰＢＳ （批 号 ０４２８Ａ１６）：雷根生物技术有限公司；ＡＬＳ１、ＨＷＰ１ 引物：上海 生 工 生 物 工 程 有 限 公 司；ＴｏｔａｌＲＮＡ 提 取试 剂 （批 号 ７４２１００）、ＰＣＲ 反 应 试 剂 （批 号 ８４１２００）：日本 ＴｏｙｏＢｏ公司；ＤＥＰＣ 处理水、Ｚｅｍｏｌ－ ｙａｓｅ酶（批号 ＳＬＢＰ５２６１Ｖ）：金克 隆（北 京）生 物 技 术有限公司；无水乙醇（批号 ２０１９０７１０ＪＮ）：天津 市 大茂化学试剂厂；琼脂糖（批号 １８２１９５）：上海沪试分析仪器有限公司；ＴＡＥ（批号 ６９０６７４２２３）：上海联 迈生物工程有限公司；ＲＰＭＩ１６４０（批号 ２０２３２３５）： 美 国 Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；沙 氏 培 养 基 （批 号 ２０１９０４２５）：青岛高科技海博生物科技有限公司。

１．３ 实验仪器

电热恒温培养箱：上海一恒科技有限公司；血细胞计数板：上海求精生化试剂仪器有限 公司；ＣＫＸ４１－３２ 型 倒 置 显 微 镜：日 本 Ｏｌｙｍｐｕｓ公 司；ＤＭＩ６００００Ｂ倒置荧 光 显 微 镜：德国徕卡光学仪 器公司；Ｒｅｇｕｌｕｓ８１００冷场发射式扫描电镜：日本日 立公司；Ｋ３ 型 酶 标 仪：赛 默 飞 世 尔 科 技 公 司；ＡＢＩ ７５００荧光定量 ＰＣＲ仪：美国应用生物系统公司。

２ 方法

２．１ 菌液配制

按方法配制菌液。从４℃ 保存的沙氏琼脂平板上挑取白念珠 菌 单 菌 落，接种 至液体沙氏培养液，３７℃恒温过夜培养，血细胞计数板 计数，ＲＰＭＩ１６４０（ｐＨ７．０）培养液稀释集落形成单位 （ｃｏｌｏｎｙｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔ，ＣＦＵ）至２×１０６／ｍＬ，备用。

２．２ ＢＡＥＰ 对白 念 珠 菌 的 最 低 抑 菌

浓 度（ｍｉｎｉｍａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ＭＩＣ）及抑 制５０％生物 膜 的 最 低 抑 制 浓 度（ｓｅｓｓｉｌｅｍｉｎｉｍａｌｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｃｏｎｃｅｎｔｒａ－ ｔｉｏｎ，ＳＭＩＣ５０）的测定 按照方法，取１００μＬ 菌液（ＣＦＵ２×１０３／ｍＬ）与１００μＬ终浓度分别为３２、 ６４、１２８、２５６、５１２、１０２４μｇ／ｍＬＢＡＥＰ 及０．５、１、２ μｇ／ｍＬＦＬＺ于９６孔板中 混 合，另 设 不 含 药 物 的 阴 性对照孔，于３７ ℃培养４８ｈ后，以肉眼观察不到菌 落的最低药物稀释度为 ＭＩＣ，实验平行重复３次。 取 ＣＦＵ 为２×１０６／ｍＬ 的菌 液１００μＬ，与１００ μＬ 终 浓 度 分 别 为 ３２、６４、１２８、２５６、５１２、１ ０２４ μｇ／ｍＬＢＡＥＰ及６４、１２８、２５６μｇ／ｍＬＦＬＺ于９６孔 板中混合，另设不含药物的阴性对照孔，３７ ℃培养 ２４ｈ后，每孔中加入５０μＬＸＴＴ－维生 素 Ｋ３ 溶液， 避光孵育２ｈ。使用多功能酶标仪检测４９２ｎｍ 处 各孔的吸光度（ｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙ，ＯＤ）值。与空 白 组 比较，以 ＯＤ 值 降 低 ５０％ 的 药 物 浓 度 为 ＳＭＩＣ５０。 ＳＭＩＣ５０的测定实验独立重复３次。

２．３ 固体培养基上观察

ＢＡＥＰ对白念珠菌菌落形 态的影响 按方法配制沙氏固体培养基，加 入终浓度为２５６、５１２、１０２４μｇ／ｍＬ 的 ＢＡＥＰ，另设 不含药物的空白对照组。用倍比稀释法将白念珠菌 悬液中 ＣＦＵ 稀释至２０／ｍＬ，取１００μＬ于固体培养 基上，用稀释 涂 布 法 涂 布 均 匀。３７ ℃培养６ｄ后， 以数码相机拍摄菌落形态。

２．４ 倒置显微镜下观察白念珠菌酵母生物膜形

态 取 ＣＦＵ 为２×１０６／ｍＬ 的菌液１ｍＬ，与１ｍＬ 终浓度分别 为２５６、５１２、１０２４μｇ／ｍＬＢＡＥＰ 及６４μｇ／ｍＬＦＬＺ于６孔板中混合，另设不含药物的阴性 对照孔，３７ ℃培养２４ｈ后，以倒置显微镜拍摄生物 膜形态。

２．５ 荧光显微镜下观察白念珠菌生物膜活性

取 ＣＦＵ 为２×１０６／ｍＬ的菌 液１ｍＬ，与１ｍＬ 终浓 度 分别为２５６、５１２、１０２４μｇ／ｍＬＢＡＥＰ及６４μｇ／ｍＬ ＦＬＺ于 ６ 孔板 中 混 合，另设不含药物的阴性对照 孔，３７ ℃培养２４ｈ后，吸弃 上 清 液，之 后 加 入 １００ μｇ／ｍＬ的 ＦＤＡ 荧光 染 料 溶 液，避 光３７ ℃染色３０ ｍｉｎ，以荧光显微镜拍摄生物膜形态。

２．６ 扫描电镜下观察白念珠菌生物膜形态结构

取 ＣＦＵ 为 ２×１０６／ｍＬ 菌液２ｍＬ 与２ｍＬ 终浓 度 分 别为 ２５６、５１２、１０２４μｇ／ｍＬ ＢＡＥＰ 及 ６４μｇ／ｍＬ ＦＬＺ混合 置 于 ６ 孔 板，另设不含药物的阴性对照 孔，分别放入 经 高 温 灭 菌 处 理 的 硅 橡 胶 导 管，恒 温 ３７ ℃培养２４ｈ后，将导管取出，置２．５％戊二醛中， 避光 ４ ℃ 放 置 ２ｈ，依 次 置 于 ３５％、５０％、７５％、 ９５％、１００％乙醇逐级脱水各１０ｍｉｎ，经室温过夜干 燥后，经 ＨＶＳ－ＧＢ 型真空蒸镀仪喷金，用 扫 描 电 镜 观察拍照。

３ 结果

３．１ ＢＡＥＰ 对 白 念 珠 菌 ＳＣ５３１４ 的 ＭＩＣ 和 ＳＭＩＣ５０ ＢＡＥＰ对白念珠菌菌落吸光度有明显影响

并且随ＢＡＥＰ浓度升高，白念珠菌菌落 ＯＤ明显 降低；ＢＡＥＰ 对 白 念 珠 菌 ＳＣ５３１４ 的 ＭＩＣ 是１０２４ μｇ／ｍＬ，１０２４μｇ／ｍＬＢＡＥＰ 对白念 珠 菌 生 物 膜 的 抑制率可达６０％以上，１２８、２５６、５１２μｇ／ｍＬＢＡＥＰ 抑制生物膜效果明显。

３．２ ＢＡＥＰ对白念珠菌在固体培 养 基 上 菌 落 形 态 的影响

观察固体培养基上菌落形态发现，空白对 照组菌落 出 现 大 量 褶 皱，边 缘 不 光 滑，２５６μｇ／ｍＬ ＢＡＥＰ组出现大量褶皱，边缘不光滑，边缘不光滑程 度小于空白对照组；５１２μｇ／ｍＬＢＡＥＰ组表面出现 少量褶皱，边缘 略 光 滑，１０２４μｇ／ｍＬ 组表 面 光 滑， 边缘光滑。

３．３ 倒置显微镜下 ＢＡＥＰ对白念珠菌生物膜形态的影响

倒置显微镜下发现，空白对照组出现大量 菌丝，ＦＬＺ 组未发现明显菌丝，２５６μｇ／ｍＬＢＡＥＰ 组菌 丝 数 量 较 阴 性 对 照 组 有 所 减 少，５１２μｇ／ｍＬ ＢＡＥＰ组更 进 一 步 减 少，１０２４μｇ／ｍＬＢＡＥＰ 组不 仅菌丝数量明显减少，且长度也明显缩短。

３．４ 荧光 显 微 镜 下 ＢＡＥＰ对 白 念 珠 菌 生 物 膜 活 性 的 影 响

经 ＦＤＡ 染 色，荧 光 显 微 镜 下 发 现，空 白 对 照 组 因 真 菌 活 力 最 高，荧 光 最 强；ＦＬＺ 组 荧 光 强 度 最 弱；２５６、５１２、１０２４μｇ／ｍＬＢＡＥＰ组 白 念 珠 菌 的 活 性、荧光强度随药物浓度递增而减 弱。

４ 讨论

近年来，随着广谱抗生素、糖皮质激素和免疫制剂 的广泛使用，外科介入疗法的不断增多，免疫功能低下 患者不断增多，真菌尤其是深部真菌感染的发生率日 渐增高，其中以白念珠菌的感染最为常见。



 

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