检测丹参中14种水溶性成分(DZF 真空干燥箱使用

丹参是唇形科植物丹参( Salvia miltiorrhiza Bre．) 的干燥根及根茎，是我国一种传统中药材，应用历 史悠久，用途广泛。据《神农本草经》记载，丹参主治 “心腹邪气”，能够“破症除瘕，止烦满，益气”，《本草 纲目》记载丹参还具有“活血，通心包络，治疝痛”等功效。

1 仪器与试药

 1．1 仪器 

Acquity H-classUPLC( 美国 Waters 公司) 包括低压四元溶剂系统、自动进样恒温样本管理器、光 电二极管矩阵检测器、ACQUITY UPLC BEH C18色谱 柱( 2．1 mm×50 mm，1．7 μm) Empower3 色谱工作站; XS-106DU 电子分析天平( 瑞士梅特勒-托利多仪器公 司，感量: 0．01 mg) ; BL15-60AA 超声波清洗机( 无锡沃信仪器制造有限公司) ; RE-52AAC 旋转蒸发仪( 上海 亚荣生化仪器厂) ; YJ-100 中药粉碎机( 济南亿健医疗 设备有限公司) ; DHG 鼓风干燥箱( 上海一恒科学仪器 有限公司) ; DZF 真空干燥箱( 上海一恒科学仪器有限 公司) ; 调温电热器( 南通利豪实验仪器有限公司) 。 

1．2 试药与试剂

 乙腈( 色谱纯，美国 Honeywell Burdick ﹠ Jackson 公司，批号: S15A1H) ; 乙酸( 色谱纯，美国 TEDIA 公司，批号: 17040594) ; 纯化水( 杭州娃哈哈集团有 限公司，批号: 20180324) 。标准物质或对照品: 丹参素钠 ( 批号: 110855-201412，含量: 98．1%) 、原儿茶酸( 批号: 110809-201205，含量: 99．9%) 、丹酚酸 B ( 批号: 111562- 201716，含量: 94．1%) 、迷迭香酸( 批号: 111871-201404，含 量: 90．5%) 购自中国食品药品检定研究院; 原儿茶醛 ［GBW09553，含量: ( 99．8±0．4) %) ］、咖啡酸［GBW09529， 含量: ( 99．5±0．7) %］、阿魏酸［GBW09518，含量: ( 99．8±0．5) %］、异阿魏酸［GBW09574，含量: ( 99．7±0．4) %］、 丹酚酸 A［含量: ( 99．1±0．4) %］购自中国医学科学院 药物 研 究 所; 9丹 酚 酸 B 单 甲 酯 ( 批 号: MUST - 17060205，含量: 99．16%) 、9’丹酚酸 B 单甲酯( 批号: MUST-171114055，含量: 99． 38%) 、丹酚酸 C ( 批号: MUST- 17031402，含 量: 99． 90%) 、紫 草 酸 ( 批 号: MUST-17053003，含量: 99．58%) 、丹酚酸 B 二甲酯( 批 号: MUST-17041614，含量: 90．04%) 购自成都曼斯特生 物科技有限公司。 不同批次的丹参样品分别购买自山东省莱芜市艾 山、九龙、罗汉峪、密埠等地。经中国医学科学院药物 研究所马辰研究员鉴定为唇形 科 植 物 丹 参 Salvia miltiorrhizaBre．的干燥根及根茎。 

2 方法与结果 

2．1 色谱条件

 色谱柱: Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱( 2．1 mm×50 mm，1．7 μm) ; 柱温 30 ℃ ; 进样 量: 1 μL; 检测波长 286 nm; 流动相: 0． 5% 乙酸溶液 ( A) -乙腈( B) ，流速: 0． 6 mL·min－1 ，梯度洗脱: 0 ～ 1．02 min，90%→80% A; ＞1．02 ～ 4．08 min，80%→72% A; ＞4．08 ～ 4．76 min，72%→55% A; ＞ 4．76 ～ 5．50 min， 55%→90%A; ＞5．50～8 min，90%A。 

2．2 溶液的制备 

2．2．1 对照品溶液的制备 

分别称取丹参素、原儿茶酸、 原儿茶醛、咖啡酸、阿魏酸、异阿魏酸、迷迭香酸、紫草酸、 丹酚酸 B、丹酚酸 A、丹酚酸 C、9丹酚酸 B 单甲酯、9'丹酚 酸 B 单甲酯、丹酚酸 B 二甲酯约 10 mg，精密称定，加入 80%甲醇溶液溶解并定容至 10 mL，得到浓度依次为 1．126，0．944，1．06，1．011，1．010，1．020，0．962，0．973，0．982， 0．968，0．996，1．049，1．067，0．904 mg·mL－1 的各对照品溶液 作为储备液，其中原儿茶酸、丹酚酸 C、9丹酚酸 B 单甲 酯、9'丹酚酸 B 单甲酯、丹酚酸 B 二甲酯稀释10 倍后作为 对照品溶液，其余 10 种成分将储备液作为对照品溶液。 精密量取上述储备液各 1 mL 至25 mL量瓶中，以 80%甲 醇溶液定容，摇匀，即得混合对照品溶液。

2．2．2 供试品溶液的制备

称取样品粉末［过三号筛 ( 50 目，孔径 355 μm±13 μm) ］约 1 g，精密称定，置于 250 mL 锥形瓶中，准确加纯化水 100 mL，加热回流 4 h，冷却过滤后将续滤液减压浓缩，放冷，并定容至 25 mL，摇匀，即得。 

2．3 方法学验证 

2．3．1 专属性实验

 取“2．2”项下对照品溶液与供试品 溶液，按照“2．1”项下色谱条件进样，记录色谱图，见图 1。

 2．3．2 线性关系考察 

分别取“2．2．1”项下各储备液 0．5，1．0，1．5，2．0，2．5 mL 至 50 mL 量瓶中，定容，摇匀，得到 5 份梯度浓度的混合对照品溶液，按“2．1”中色谱 条件进行分析，以各成分浓度为横坐标，峰面积为纵坐 标绘制标准曲线，得到 14 种水溶性成分的线性方程及 范围，见表 1。

2．3．3 精密度实验

 取“2．2．1”项下对照品溶液，按照 “2．1”项下色谱条件连续进样 6 次，测得峰面积，14 种 成分 RSD 值处于 0．19% ～ 1．81%，小于 2%，表明仪器 精密度良好。

 2．3．4 稳定性实验

取上述“2．2．2”项下供试品溶液， 分别于 0，2，4，8，12，24 h 进样测定峰面积，14 种成分 在各时间点的峰面积的 RSD 值处于 0．57% ～ 0．51%， 小于 2%，证明供试品溶液稳定性良好。 

2．3． 5 重复性实验

取样品 2 ( 罗汉峪直径 0． 1 ～ 0．5 cm的丹参药材样品) ，按照“2．2．2”项方法制备 6 份供试品溶液，按照“2．1”项下色谱条件进样检测，记 录各成分峰面积，14 种成分平均含量 RSD 值处于 0．04% ～1．24%，小于 2%，表明方法重复性良好。

3 讨论

测定丹参中水溶性成分的色谱条件中，流动相的有机相多为乙 腈或者甲醇，非有机相多为乙酸溶液或磷酸溶液，柱温 集中在 20～40 ℃，波长范围在 200 ～ 290 nm，为探求最 合适的色谱条件，笔者对流动相( 甲醇-0．5%乙酸溶液、 乙腈-0． 5% 乙酸溶液、乙腈-0． 1% 磷酸溶液) 、波长 ( 210，254，286 nm) 、柱温( 20，30，35 ℃ ) 进行考察，当 流动相为甲醇-0．5%乙酸溶液时，所测成分间的分离度 较低，当流动相为乙腈-0．1% 磷酸溶液时，酸性较大的 成分( 如丹酚酸 A) 易产生拖尾，而流动相为乙腈-0．5% 乙酸溶液时，峰形与分离度均较为理想; 当波长为 210 nm时，溶剂效应显著，当待测成分含量较低时易被 溶剂峰掩盖，而波长为 254 nm 时，大部分成分的紫外 吸收值变小，有些成分响应值甚至减小到 286 nm 下的 一半，所以选定波长为 286 nm; 当柱温为 20 ℃时，色谱 峰出现前延，当柱温为 35 ℃时，出峰时间太短，分离度 欠佳，故最终选择的柱温为 30 ℃ ; 结合上述考察结果 最终确定当流动相为乙腈-0．5%乙酸溶液，检测波长为 286 nm，柱温 30 ℃时各成分的分离效果及峰形最好。

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