蜡样芽孢杆菌产磷脂酶D发酵条件分析（一恒摇床

磷脂酶D（phospholipase D，PLD）是一类特殊的酯键 水解酶，能催化水解磷脂分子中的磷酸和羟基化合物的羟 基成酯的P-O键，水解产物为磷脂酸（phosphatidic acid，PA） 和羟基化合物，如水解磷脂酰胆碱（phosphatidyl cholines， PC）生成PA和胆碱；在特定条件下，PLD还能催化PA转移 至其他的含羟基化合物（如丝氨酸、果糖等）形成新的酯 键，也称为转磷脂酰基反应。PLD催化的转磷脂酰基反 应有重要的应用价值，可以用于磷脂的定向改造、药物的 合成以及单一磷脂、稀有磷脂的制备[4-8]。

1 材料与方法 

1.1 材料与试剂

蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）：实验室筛选获得。 卵黄LB固体培养基：在LB固体培养基中添加20 g/L卵黄。 硼砂卵黄固体培养基：NaCl 6.6 g/L、硼酸10.9 g/L、硼砂 1.9 g/L、琼脂粉20 g/L、卵黄20 g/L，pH7.2～7.4。 基础发酵培养基：葡萄糖10 g/L、蛋白胨10 g/L、牛肉粉 1 g/L、NaCl 3 g/L、MgSO4 ·7H2O 0.5 g/L、CaCl2 1 g/L，pH值 6.5～7.0，种子培养基同基础发酵培养基。 磷脂酶D活性分析试剂盒（比色法）：美国Bio Vision公 司；LB固体培养基、蛋白胨、牛肉粉、琼脂粉（均为生化试 剂）：青岛海博生物有限公司；十二烷硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid， EDTA）：国药集团化学试剂有限公司；卵黄取自新鲜鸡蛋， 其他试剂均为国产分析纯。 

1.2 仪器与设备

 LHS-250SC电热恒温恒湿培养箱、THZ-100B恒温培 养摇床：上海一恒科学仪器有限公司；Infinite 200 PRO多功 能酶标仪：瑞士帝肯有限公司。 

1.3 方法

 1.3.1 发酵方法 

取生长良好的斜面菌种1～2环，接种到种子培养基中， 36 ℃、200 r/min摇瓶培养10 h得到种子液。取适量种子发酵液，按照一定的接种量接入发酵培养基中，在一定温度、 200 r/min条件下培养一定时间后，取样测定发酵液中PLD 的水解酶活力及菌体浓度。 

1.3.2 粗酶液制备 

将发酵液在4 000 r/min条件下离心20 min，取上清液即 为粗酶液。 

1.3.3 磷脂酶D活力测定

硼砂卵黄平板牛津杯法测酶活：取100 μL稀释后的 粗酶液置于等距放置在硼砂卵黄平板上的牛津杯中，36 ℃ 温育24 h，所产生的乳白色晕圈的大小即代表酶活力的高 低。为使结果具有可比性，硼砂卵黄平板采用同一规格的 平皿，加入等量同批次硼砂卵黄固体培养基。为消除不同 pH及酶浓度过高对晕圈反应的影响，粗酶液用一定pH缓冲 液稀释10倍作为晕圈反应测定液，每个样品平行测定3次， 取平均值。PLD水解活力测定采用酶联比色法：利用PLD 水解磷脂酰胆碱产生胆碱，胆碱在胆碱氧化酶和过氧化物 酶的作用下形成红色显色物质，在波长500 nm下有最大吸 收峰。本研究使用市售的根据该原理制备的磷脂酶D活性 分析试剂盒（比色法）测定粗酶液中PLD水解PC产生胆碱 的水解酶活性，操作方法根据试剂盒使用说明书进行。酶 活定义为在25 ℃、pH7.4条件下，以PC为底物，每分钟生成 1 μmol胆碱所需要的酶量为一个酶活力单位（U/mL）。由于 该测定方法中胆碱氧化酶和过氧化物酶价格昂贵，故本研 究中酶活初步鉴定采用硼砂卵黄平板牛津杯法。 

1.3.4 菌体浓度测定 

取发酵液1 mL于100 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至 100 mL，于波长660 nm处测定吸光度值，试验过程中做3组 平行试验。

2 结果与分析

在基础发酵培养基的基础上，改变碳源种类，分别以 10 g/L葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘油、淀粉及卵黄为碳源，接种 量2%，于36 ℃、200 r/min培养24 h，测定晕圈直径，结果见 图1。由图1可知，以10 g/L卵黄作为碳源产酶活力较高。以卵黄为碳源，改变卵黄添加量分别为10 g/L、20 g/L、 25 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L，培养基初始pH7.0，接种量为 2%，于36 ℃、200 r/min培养24 h，测定晕圈直径，结果见图2。 由图2可知，卵黄添加量为20 g/L 时，发酵液中酶活力较好， 继续提高卵黄含量，酶活力下降，可能由于卵黄含量过高， 培养基液体黏度过大，影响了微生物需氧。

3 结论

该研究对蜡样芽孢杆菌产PLD发酵条件进行了优化， 通过单因素和正交试验确定培养基最佳组成为卵黄10 g/L、 蛋白胨15 g/L、牛肉粉2 g/L、MgSO·4 7H2O 1 g/L、氯化钠3 g/L。 最适培养条件为培养基初始pH8.0，接种量1.0%，于36 ℃、200 r/min培养8 h。在最适发酵条件下进行3批试验，采用 酶联比色法测PLD活力，平均酶活达到4.21 U/mL，具有发 酵周期短，产酶速度快的特点，为磷脂酶D工业化生产和 应用奠定基础。

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