猫爪草内生真菌的分离(LRH-150使用)

猫爪草( Ｒadix ranunculi ternati) 为毛茛科植物小 毛茛( Ｒanunculus ternatus Thunb．) ，是中国的传统中 药，其味甘、辛，性温，具有清热、解毒、散结消瘀之功 效。猫爪草含有多糖、皂苷、黄酮类、生物碱类、氨基 酸等多种活性成分，具有调节免疫、抗氧化、抑菌、抗 肿瘤等作用，是目前唯一上市的抗结核中药。当 前，猫爪草由于生长周期长，且野生资源不规范采挖， 栽培品种退化严重，次生代谢产物的含量不稳定等因 素，致使药材的产量和质量有所下降。

1 材料

1. 1 猫爪草样品

长势健康、株高约 20 cm 的未开花猫爪草植株， 采自信阳农林学院校区药用植物园，采样时将整株植 物拔出，带至实验室后立即进行内生真菌的分离。

1. 2 供试病原菌

病原细菌: 大肠杆菌( Escherichia coli) 、金黄色葡 萄 球 菌 ( Staphylococcus aureus ) 、沙 门 氏 杆 菌 ( Salmonella enterica) ，均由信阳农林学院生物与制药 工程学院微生物实验室保存。 病原真菌: 禾谷镰孢菌( Fusarium graminearum) 、 核盘菌( Sclerotinia sclerotiorum) 、灰葡萄孢菌( Botrvtis cinerea) 及球黑孢菌( Nigrospora sphaerica) ，均由信阳 农林学院农学院植物病理实验室提供。

1. 3 主要试剂

无水乙醇、葡萄糖、琼脂粉等，均购自天津市科密 欧化 学 试 剂 有 限 公 司; CTAB ( C8440 ) 、氨 苄 西 林 ( 0339) ，购自北京索莱宝生物科技有限公司; 引物 ITS4、ITS5，均均由南京金斯瑞生物科技有限公司合 成; DNA 凝胶纯化回收试剂盒、dNTP、Taq DNA 聚合 酶等，均购自天根生化科技( 北京) 有限公司。

1. 4 主要仪器

生化培养箱( 型号为一恒LＲH-150) ，购自上海一恒 科技有限公司; 智能恒温培养振荡器( 型号为 HNY－ 200B) ，购自天津欧诺仪器股份有限公司; 旋转蒸发仪( 型号为 ＲE－522AA) ，购自上海亚荣生化仪器厂; 全自动高压灭菌锅( 型号为 YXQ－75S II) ，购自北京勤诚盛达科学仪器有限公司; 超净工作台( 型号为 SW－CJ－2G) ，购自上海苏净实业有限公司。

2 方法

2. 1 内生真菌的分离纯化

将采集的新鲜猫爪草先用自来水冲洗干净，滤纸 吸干水分，转至超净工作台; 75%乙醇浸泡 1 min，用 无菌水冲洗 1 次; 再放入 0. 1% 升汞溶液中 5 min， 75%乙醇浸泡 1 min，用无菌水冲洗 5 次，无菌滤纸吸 干。用无菌刀将根、茎切成 0. 5 cm 小段，叶子切成 0. 5 cm×0. 5 cm 小块，分别置于含有 100 U /mL 青霉 素的 PDA 培养基中进行内生真菌的分离，取 200 μL 无菌水最后一次漂洗液涂 PDA 培养基作为对照，培 养基密封后，28 ℃ 黑暗培养约 1 个月，期间定期观察 菌丝生长情况，及时挑取菌丝纯化培养 4 ～ 6 次，编号 并接种到 PDA 试管斜面培养基上培养，待培养基长 满菌丝后置于冰箱 4 ℃保存，备用。

2. 2 目标菌株形态学观察

取少量待测内生真菌菌丝点置于 PDA 培养基 中，倒置放于 28 ℃ 恒温箱中培养 6 ～ 15 d，每天定期 观察菌落大小、质地、边缘形态、颜色等。在菌落生长 的中后期挑取少量菌丝在光学显微镜下观察记录菌 丝、是否有横隔及孢子的形态特征等。根据《真菌鉴 定手册》中描述的真菌形态特征进行初步鉴定。

2. 3 目标菌株的分子鉴定

将待测菌株接种至 PD 液体培养基中，培养 7 d， 4 000 r /min 离心 20 min 收集菌丝，采用 CTAB法提取基因组 DNA，利用通用引物( 上游引物 ITS4 5'－ GGAAGTAAAAGTCGTAAGG－3'和下游引物 ITS5 5'－ TCCTCCGCTTATTGATATGC － 3') PCＲ 扩 增 5. 8S rDNA 及 18S rDNA 与 28S rDNA 之间的间隔序列，扩 增得到的内生真菌凝胶回收后进行测序，获得的序列 在 NCBI GenBank 中进行 BLAST 同源性比对，下载相 似度较高的相关参考菌株的 ITS 序列，利用 Clustal X 1. 81 及 MEGA 5. 2 进行系统发育分析，确定待鉴定 菌株的种属。

2. 4 菌株发酵液的制备

从 4 ℃保存的 PDA 斜面培养基上挑取已分离纯 化的少量目标菌丝接种到新的 PDA 培养基上; 28 ℃ 培养，待菌丝覆盖 PDA 培养基表面，用直径 5 mm 打 孔器打制 5 个圆形菌斑块，置于含 250 mL PD 液体培 养液的 500 mL 三角瓶中，于 28 ℃，150 r /min 摇床振 荡培养 14 d，4 000 r /min 离心 20 min，分离菌丝和发 酵液，将发酵液于 50 ℃减压浓缩至干，得到的提取物 浸膏用纯化水配制成浓度为 5 mg /mL，作为供试品溶 液，备用。

2. 5 菌株抗细菌活性的测定

采用圆纸片法对病原细菌( 大肠杆菌、金黄色葡 萄球菌、沙门氏杆菌) 进行抑菌活性试验。取 37 ℃ 静置培养 16 ～ 24 h 的供试细菌 LB 菌悬液( 浓度为 1× 10－5 ～ 1×10－6 cfu /mL) 100 μL，均匀涂布于 LB 固体培 养基上，放置 0. 5 h 后，将浸有待测菌株发酵液的灭 菌滤纸片贴在培养基上，重复 3 次，37 ℃ 培养 16 ～ 24 h 后观察并测定抑菌圈直径。

3 结果与分析

采用组织块分离法从处于营养生长时期的新鲜 猫爪草植株中共分离到 23 株内生真菌。其中来源于 根 2 株，茎 9 株，叶 12 株，分别为分离菌株数量的 8. 7%、39. 1%和 52. 2%，可见内生真菌的分布有不同 的组织偏好。菌落形态和显微结构存在较多差异 ，提示形态及分类地位具有较为丰富的多样 性。产色素方面也存在较多差异，有产红色素、紫色 素、白色素、灰色素及黑色素等色素类型。初步判断 这 23 株内生真菌包括 6 株枝孢菌，5 株镰刀菌，5 株 链格孢菌，3 株刺盘孢菌，1 株烟曲霉菌，1 株青霉菌 及 2 株丛梗孢菌。分离同种菌株的数量表明，枝孢菌 ( 26. 1%) 、镰刀菌( 21. 7%) 及链格孢菌( 21. 7%) 是 猫爪草内生真菌的优势菌。

4 讨论

关于药用植物猫爪草内生真菌的分离还未见报 道，为了丰富内生真菌种类及其宿主植物的多样性， 本研究初步选取了营养生长阶段的栽培猫爪草植株 作为材料，分离其内生真菌。分离的内生真菌数量表 明，枝孢菌、镰刀菌及链格孢菌是猫爪草内生真菌的 优势菌群。从抑菌活性分析，有约 1 /3 的菌株对金黄 色葡萄球菌有抑制活性，而猫爪草水提取物也可抑制 金黄色葡萄球菌，表明从猫爪草内生真菌中筛选 同猫爪草相同的抗菌活性物质的途径是可行的。从 内生真菌抗菌种类分析，本试验分离的 5 株镰刀菌中 有 4 株具有不同程度的抗细菌和抗真菌作用。有人 已从喜树( Camptotheca acuminate) 中分离到一种内生 真菌镰刀菌具有抗癌活性，暗示猫爪草中的镰刀 菌次生代谢物也可能具有与宿主类似的抗氧化、抗癌 等多种生理活性的潜能。



 

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