预测羟基芫花素肝毒性风险

芫花( Genkwa Flos ) 为瑞香科植物芫花( Daphnegenkwa Sieb． et Zucc． ) 的干燥花蕾。其功能为逐水 涤痰，主要用于治疗胸胁停饮、肿胀腹水、喘咳引 痛等疾病。研究表明，芫花具有镇咳、祛 痰、 抗肿瘤和免疫调节等药理作用。由于其明确的抗 肿瘤活性，临床长期应用所导致的不良反应屡次 出现，其中肝损伤所占比例最为严重，目前已 引起关注。

1 药品与试剂

人肝微粒体( HLM，美国 BD Gentest 公司) ; 磷 酸钾( 纯度≥98% ) 、氯化镁( 纯度≥98% ) 、抗坏血 酸( 纯度≥98% ) 、三羟甲基氨基甲烷( Tris，纯度≥ 98% ，百灵威科技公司) ; 葡萄糖二酸单内酯( 纯度 ≥98% ) 、丙甲菌素( 纯度≥98% ) 、尿苷二磷酸葡萄 糖醛酸( UDPGA，纯度≥98% ) 、二甲基亚砜( DMSO， 纯度≥98% ，Sigma Aldrich 公司) ; 胆红素( 批 号: 100077-201206，含量: 99． 3% ) 、羟基芫花素( 含量 ＞ 98% ，成都瑞芬思生物科技有限公司) ; 甲酸、盐酸( 北京化学试剂厂，分析纯) ; 乙腈、甲醇( Fisher 公 司，色谱纯) 。

2 仪器

AcquityTM Ultra Performance LC 超高效液相色谱 仪( 美国 Waters 公司) ; AE240 电子天平( 瑞士梅特勒-托利多公司) ; SDC 6 节能职能恒温槽( 宁波新芝生物科技股份有限公司) ; 17Ｒ 高速低温离心机 ( 美国 Thermo 公司) 。

3 同源模建

UGT1A1 是由 534 个氨基酸残基组成的Ⅱ相代 谢酶，由于目前尚未确定 UGT1A1 的 N-末端结构 域，因此采用 Discovery Studio 2． 5 BLAST Search 模 块进行序列比对，通过分析其同源性和相似性的高 低，选择相似性较高的 4 种蛋白作为模板蛋白进行 同源模建。采用 Modeller 9． 13 程序，基于逐级能量 最小化方法，约束所有重原子后，依次优化氢原子， 优化侧链及 Loop 区。能量最小化过程采用最陡下 降法和共轭梯度法进行优化。最后基于拉氏图和 Profile-3D 分析对同源模建蛋白进行评价，最终构建 出 UGT1A1 酶蛋白结构。

4 分子对接实验

利用 Discovery Studio 2． 5 的 From Ｒeceptor Cavities 模块对蛋白空腔进行自动识别，并利用活性值 与打分值的相关性系数对活性口袋进行评价，分析 待测单体羟基芫花素与 UGT1A1 酶蛋白的作用方 式，同时计算二者复合物结合自由能，用以判断亲和 作用强弱。

5 人肝微粒体体外抑制实验

5． 1 色谱条件

Acquity UPLC HSS C18柱( 100 mm × 2. 1 mm，1． 8 μm) ; 预柱: Acquity UPLC HSS C18 VanGuard Pre-column( 5 mm × 2． 1 mm，1． 8 μm) ; 流 动相: 乙腈( A) -0． 1% 甲酸水溶液( B) ，梯度洗脱 ( 0 ～ 2． 1 min，40% A→75% A; 2． 1 ～ 4． 2 min，75% A→95% A; 4． 2 ～ 8． 0 min，95% A; 8． 0 ～ 8． 5 min， 95% A→40% A; 8． 5 ～ 12． 5 min，40% A) ; 流速: 0． 4 mL·min － 1 ; 柱温: 35 ℃ ; 检测波长: 450 nm; 进样量: 10 μL。

5． 2 UDPGA-发生系统的制备

精密称取氯化 镁、葡糖二酸单内酯、丙 甲 菌 素、UDPGA 适 量，用 Tris-HCl 缓冲液( 称取 Tris 121． 1 g，加入去离子水 800 mL，加浓盐酸调 pH 至 7． 4，以去离子水定容至 1 000 mL) 使溶解，使含氯化镁 5 mmol·L － 1，葡糖二 酸单内酯 5 mmol·L － 1，丙甲菌素 25 μg·mL － 1，UDP-GA 5 mmol·L － 1，即得 UDPGA-发生系统。

5． 3 溶液的制备

采用已建立的人肝微粒体孵育 体系( HLM) ，测定羟基芫花素对 UGT1A1 酶 的抑制作用，以表观抑制常 数( Ki ) 为评 价 指 标。 取蛋白为 0． 5 mg·L － 1的 HLM 30 μL 放至室温，复 融后，加入系列浓度的底物胆红素对照品溶液 ( 0. 52 ～ 2. 37 μmol·L － 1 ) 及待测单体羟基芫花素对 照品溶液( 0． 38 ～ 12． 41 μmol·L － 1 ) ，置 37 ℃ 恒温水 浴预孵育 3 min 后加入新鲜配制的 UDPGA-发生系 统溶液 68 μL 启动反应。反应 10 min 后立即加入 600 μL 冰乙腈-甲醇( 2 ∶ 1，含抗坏血酸浓度为 200 μmol·L － 1 ) 终止反应，沉淀蛋白，涡旋 1 min，于 13 000 r·min － 1 ( r = 5 cm) 离心 25 min，取上清液即刻进 行测定［体系终体积为200 μL，DMSO 总用量不超过 1% ( v / v) ］。

6 结果

利用 Discovery Studio 2． 5 的 From Ｒeceptor Cavities 模块对 UGT1A1 蛋白空腔进行自动识别，共获 得 9 个口袋( A ～ I 活性口袋) ，坐标及半径如表 1 所示。

将单体羟基芫花素( 结构见图 1) 与 UGT1A1 酶 蛋白进行对接，选择能够接纳化合物且相关系数相 反数最大的口袋作为活性口袋。对接结果显示，芫 花素在 site F 的打分值为86． 374 5，高于其他活性位点的打分值，因此羟基芫花素的结合口袋确定为 site F。

7 结论

研究首先通过分子对接技术构建 UGT1A1 酶蛋 白结构，将待测单体羟基芫花素与 UGT1A1 酶蛋白 对接，明确二者结合靶点以及结合强弱，初步推测羟 基芫花素与 UGT1A1 酶的结合位点为活性区 F，与 其底物胆红素活性位点重合，但对接结果显示羟基 芫花素与 UGT1A1 酶亲和性较弱，因此提示羟基芫 花素对 UGT1A1 酶活性影响较小，潜在肝毒性风险 小。另一方面，体外人肝微粒体实验结果显示，羟基 芫花素对人源 UGT1A1 酶具有弱抑制作用，抑制类 型为竞争型抑制，与计算机分子对接结果相一致。