铝诱导的茶树根系转录组变化分析

在中性或中等酸性土壤中，Al 主要以不 溶性沉积物的形式存在。但在酸性土壤 （pH<5.0）中，Al 以 Al3+、Al(OH)2+和 Al(OH)2 + 等形式被溶解释放到土壤溶液，从而抑制根系 的生长，减少水分和养分的吸收，导致作物减 产。因此，Al 毒是酸性土壤中作物产量的主 要限制因素。茶树适宜生长在 pH 为 4.5~5.5 的酸性土壤中，作为一种 Al 超富集植物，其 体内 Al 含量是其他植物的几十到几百倍，且 不表现毒害症状，适宜浓度的 Al 能明显促进 茶树生长。

1 材料与方法

1.1 植物材料与处理

供试材料为福鼎大白茶生长良好、大小一 致的一年生扦插苗，茶苗由湖北大悟县半兵卫 茶业有限公司提供。2018 年 3—8 月，试验培 养箱采用 40.0 cm×30.0 cm×15.0 cm 的蓝色不 透明塑料箱，箱盖带有 20 个独立开孔，每孔 放入 1 株茶苗，用海绵固定，培养室光照强度 ＞450 μmol·m-2；温度(22~25)℃，16 h 光照/8 h 黑暗，空气湿度 65%~85%。先用纯蒸馏水预 培养 3 d。随后移至营养液中。营养液参照文 献的配方，用 0.1 mol·L-1 H2SO4 或 NaOH 调 pH 至 5.0，每隔 7 d 更换 1 次营养液并持续通 气。待茶苗长出大量白色吸收根后用于后续 Al 处理。Al 处理采用 A12(SO4)3·18H2O，设置 0、0.2、1、2、4 mmol·L-1 5 个 Al3+浓度，各 组重复 3 次。处理 7 d 后，取每盆 5 株茶树幼 根于液氮速冻，作为 1 个重复样，然后置于–80℃ 冰箱保存，备用。

1.2 抗氧化酶活性测定

采用南京建成生物工程研究所的总超氧 化物歧化酶（T-SOD）测试盒（羟胺法）、过 氧化氢酶（CAT）测定试剂盒（可见光法）、 过氧化物酶（POD）测定试剂盒（比色法）、 抗坏血酸过氧化物酶（APX）测试盒（紫外比 色法），根据试剂盒提供的说明测定茶树根系 总 SOD、CAT、POD、APX 4 种抗氧化酶活 性，3 次生物学重复。

1.3 Al 含量测定

Al 含量测定参考王敏等方法。取液氮磨 碎的鲜样 0.4 g 至玻璃消化管，依次加入 5 mLHNO3 与 2 mL HClO4，盖上盖子，60℃预消煮 2 h 后，120℃消煮至消煮液无色澄清透明，冷 却后，用双蒸水稀释至 50 mL。取 10 mL 使用 ICP-OES（电感耦合等离子体原子发射光谱法） 测定 Al 元素的含量，每个处理 3 次生物学重 复。标准曲线绘制：用 1%稀硝酸将 Al 标准储 备液（国家有色金属及电子材料分析测试中心） 逐级稀释为 0、5、10、30、40、50 µg·mL-1， 仪器自动绘制标准曲线。

1.4 总 RNA 提取、cDNA 文库构建及转录组

测序 每个处理 3 次生物学重复，每个生物学重 复由 5 株茶树根系混合而成。采用改良的 CTAB 法提取茶树根系总 RNA，Nanodrop 检测 RNA 浓度，1%的琼脂糖电泳检测 RNA 完整性，Labchip 对 RNA 精确质检。质检合 格后送武汉博越致和生物科技有限公司构建 RNA-Seq 文库，并在 Illumina Hiseq Xten 平台 上进行测序。

1.5 数据质控及过滤

测序得到的原始图像数据文件经碱基识 别（Base calling）分析转化为原始测序序列 （Raw reads），结果以 FASTQ 文件格式存储， 其中包含测序序列（Reads）的序列信息及其 对应的测序质量信息。Raw reads 经过滤去除 接头序列和低质量序列得到获得纯净 reads （Clean reads）。

1.6 参考序列比对分析

采用 Hisat2 软件，以茶树基因组作为 参考基因组，将 clean reads 比对到参考基因组 序列，使用 Hisat2 软件，参考基因组选 “C.sinensis.genome.fa”文件，注释文件选择 “C.sinensis.gene.gtf”文件，对测序得到的 reads 比对情况做出评价。本研究所有基因注 释 ID 都以茶树基因组基因 ID 表示。

1.7 差异表达基因的筛选和功能注释

采用 FPKM 值（Fragments per kilo basesper million mapped reads，代表每百万 reads 中 来自于某基因每千碱基长度的 reads 数）来反 映基因的表达量。采用 DESeq2 表现基因的 读段数在不同生物学个体之间的差异。在 DESeq2 的统计结果中，通过差异倍数和 FDR（False discover rate）≤0.05 为筛选条件，在 3 个转录组比较 组合中（R1 VS R0，R4 VS R0，R4 VS R1） 筛选差异表达基因。对找到的差异表达基因利 用 EggNOG 数据库（http://eggnogdb.embl.de） 和 emapper 工具进行 GO 注释，获得基因的 Orthologous groups，然后用 R 语言的 phyper 函数进行超几何分布检验。以 Q-value≤0.05 为阈值定义差异表达基因中显著富集的 GO terms。采用R语言的clusterProfiler包进行KEGG （Kyoto encyclopedia of genes and genomes）富 集分析，确定差异表达基因参与的代谢途径。

1.8 差异表达基因荧光定量

PCR 验证 随机选取 8 个差异表达基因，利用 Primer Premier 6 软件设计引物（表 1），将 1.4 章节 中提取的 RNA 采用 cDNA 第一链合成试剂盒 （杭州新景）反转录为 cDNA，以 cDNA 为模 板，CsGAPDH 为内参，采用 2×SYBR Green PCR Mix 试剂盒（杭州新景），在 ABI 7500 Fast 荧光定量 PCR 仪（ABI 公司，美国）上进行 荧光定量检测。每个样品设 3 次技术重复，依 照 C T - 2  法计算相对表达量。

2 结果与分析

植物遭受逆境胁迫时体内产生活性氧，引 起膜脂过氧化和膜系统损伤，而抗氧化酶可清 除植物体内的活性氧，且不同酶对逆境有不同 的响应。由图 1 可知，无 Al3+时根系 POD 活 性显著高于其他 Al3+浓度下 POD 活性，且随 着 Al 浓度的升高，根系 POD 活性逐渐下降。 SOD 活性在 Al3+浓度为 1 mmol·L-1 时最高，其 他处理无显著差异。APX 活性随着 Al3+浓度的增加逐渐升高。不同 Al3+浓度处理下茶树根 系 CAT 活性无显著差异。测序原始数据碱基组成基本平衡，并且碱 基百分比（Q30）大于 92%。充分说明测序得 到的数据质量可靠，可满足后续分析。9 个样 品共得到 3 137.9 万~4 292.6 万对 100 bp 的 reads，将包含测序接头和低质量 reads 去除后， 得到 1 984.2 万~4 154.3 万对 clean reads，占原 始序列的 93.5%~98.0%。与茶树基因组进行基 因序列比对，从比对结果来看（表 2），R0、 R1、R4 平均分别有 67%、69%和 67%的 reads 能有效地比对到参考序列上，成功注释到参考 基因的 unique reads 占总 reads 的比例依次为50.1%、47.0%和 46.4%。

3 讨论

上海一恒认为应用 RNA-Seq 技术对茶树无 Al3+ （0 mmol·L-1，R0）、适宜 Al3+（1 mmol·L-1， R1）和高 Al3+（4 mmol·L-1，R4）浓度处理下 的根系转录组进行了比较分析，获得了大量差 异表达基因。GO 功能富集分析显示这些差异 表达基因所参与的生物学过程主要包括刺激 和胁迫响应、氧化还原反应等过程。差异表达 基因的分子功能主要包括核酸结合转录因子、 果胶酯酶、氧化还原以及物质转运等功能。差 异表达基因的 Pathway 显著性富集分析进一 步表明差异基因广泛涉及转录因子、转运蛋白、 植物-病原菌互作、苯丙烷生物合成等生物学 路径。