浅谈白色念珠菌生物膜形成因素

白色念珠菌（Canidia albicans）一种条件治病真 菌，当机体免疫功能下降时，白色念珠菌将大量繁殖 入侵机体细胞导致疾病发生 。菌群与上皮细胞表 面的受体结合并分泌出胞外多糖或蛋白，形成的膜 状物，即生物膜。与浮游细胞相比，生物膜将自身包 裹在自发粘附的多糖和蛋白质层中，使白色念珠菌 粘附到表面，可防治药物的杀菌作用 ，具有抵抗更 高水平的抗真菌剂的能力，并且可以产生对常用治 疗的耐受性 。生物膜的形成是白色念珠菌产生耐 药性的主要原因之一 。因此，筛选生物膜抑制剂的 研究方向具有很大意义。

高速冷冻离心机，高压灭菌锅，电子天平，96 孔 板，恒温振荡仪，酶标仪

致病菌株：白色念珠菌 ATCC 64550（Canidia al⁃ bicans ATCC 64550），购于美国典型培养物保藏中心 ATCC。拮抗菌株：放线菌菌株 TRM43355 分离于新 疆阿拉尔市塔克拉玛干沙漠的流动风沙。

高氏一号培养基（1 L）；AM6 培养基（1 L）；YPD 培养基；SDB培养基，培养见《微生物实验指导》。 试剂：(NH4)2SO3；CuSO4·5H2O；FeSO4·7H2O；Mn⁃ SO4·H2O；ZnSO4·7H2O；CH3OH。

TRM43355 的分类学鉴定 根据张仁文等报道的用酶解法提取链霉菌基 因组总DNA并进行16S rRNA基因的PCR扩增，并委 托上海生物工程有限公司测序。使用 EzTaxon 数据 库与来自最密切相关的链霉菌属物种的序列进行多 重比对，以及序列相似性的计算。通过 MEGA 软件 中 邻 接 法（Neighbor - Joining，NJ）构 建 系 统 发 育 树 ，明确其分类学地位。

将放线菌菌株 TRM43355 接种于高氏一号固体 培养基于 37 ℃培养 5-7 d。将单菌落接种于 AM6 液 体发酵培养基，每瓶 150 mL，37 ℃，180 r/min 振荡培养 7-10 d。发酵液用纱布过滤，除去大颗粒的菌体， 再用 50 mL 离心管，10000 r/min 离心 10 min，以备后 续使用。

将发酵液分别通过D-101大孔树脂吸附 ，分别 用 30 %、50 %、70 %、95 %甲醇洗脱，收集不同阶段 组分，膏状 50 ℃烘干备用。称取适量浸膏用 5 % DMSO溶解，过0.22 µm无菌微孔滤膜，-20 ℃待用。

将放线菌菌株 TRM43355 的发酵液用纱布过滤 后，10000 r/min 离心 10 min，收集上清，再按 70 %的 浓度加入饱和硫酸铵 ，置于搅拌 30 min，4 ℃静置 过夜，10000 r/min 低温高速离心 15 min，收集沉淀。 用少量 PBS（磷酸盐缓冲液）溶解沉淀，用 MW8000- 10000 的透析袋4 ℃透析48 h。奈氏试剂检测透析液 中的 NH4+ 是否残留。将无残留 PBS溶解的粗蛋白溶 液冷冻抽干，存放-20℃备用。

采用微孔板半定量方法 检测蛋白对念珠菌生 物膜形成能力的影响。用 PBS 配制蛋白母液浓度为 2 mg/mL，经过 0.22 µm 微孔滤膜过滤，置于 96 孔板 中，进行倍性稀释，获得蛋白浓度为 1000~3.91 μg/ mL 检测不同蛋白浓度对白色念珠菌生物膜形成 能力的影响。

取 100 μL 的菌株 TRM43355 发酵液分段产物溶 液（30 %、50 %、70 %、95 %不同甲醇相组分浸膏）和 100 μL 的菌液（将培养 72 h 白色念珠菌菌液按 1:10 稀释，菌液浓度为 1.205×107 CFU/mL）加至 96 孔板 中，混匀，4 个孔为一组平行实验。37℃培养箱静置 培养 72 h 后用酶标仪检测生物生长量，蒸馏水冲洗 三次，洗去未黏附的浮游真菌，60 ℃烘箱1 h，用0.5% 结晶紫染色5 min，用蒸馏水冲洗后室温下自然晾干， 用酶标仪测定ATCC 64550白色念珠菌生物膜形成能 力，相对生物膜形成能力=（处理组 OD490/空白对照OD490）×100。

TRM 43355经过16S rRNA基因序列比对分析结 果表明此菌株属于链霉菌属，与数据库中Streptomyces barkulensis RC 1831T 具 有 最 高 相 似 性 ，相 似 度 为 99.06%。与其它链霉菌属种亲缘关系如图1所示。

使用微孔板半定量法检测发酵液的提取物对白 色念珠菌ATCC 64550生物膜形成的影响。菌株 TRM 43355 的粗蛋白对白色念珠菌生物膜 形成具有很好的抑制效果，抑制率高达 88.12 %，其 70 %、95 %甲醇洗脱分子的活性也比较显著。后续 实验就放线菌 TRM 43355发酵液中的粗蛋白深入研 究。为了确定菌株 TRM 43355 发酵液中蛋白对白色 念珠菌生物膜形成的最小抑膜浓度，用不同浓度蛋 白，采用微孔板定量法测试活性。粗蛋 白浓度为 2 mg/mL 时对白色念珠菌生物膜形成抑制 率为 93%。当蛋白浓度 0. 25 mg/mL、0. 5 mg/mL 和 1 mg/mL 时相对生物膜形成能力分别为 96. 31 %、 82. 98 %和86. 89 %，当蛋白浓度为 2 mg/mL、2. 5 mg/ mL 和 3 mg / mL 时 相 对 生 物 膜 形 成 能 力 分 别 为 6. 48 %、7. 71 %和 7. 75 %；蛋白浓度为 0. 25 mg/mL、 0. 5 mg/mL和1 mg/mL时几乎不能达到抑制生物膜的 效果，蛋白浓度为 2 mg/mL、2. 5 mg/mL 和 3 mg/mL 时 抑制生物膜的效果较好，抑制率可达90 %以上，因此 不同的蛋白浓度对白色念珠菌生物膜形成影响较 大，蛋白浓度越高生物膜形成能力越弱，抑制率越 强；浓度为 2 mg/mL 的蛋白浓度为最佳，继而后续活 性测试都采用蛋白浓度为2 mg/mL。

上海一恒通过上述分析得出生物膜起到屏障保护作用，使药物很难作用菌 群，因此生物膜的形成是白色念珠菌产生耐药性主 要原因之一。白色念珠菌对大部分抗真菌药物产生 多重耐药性，这些使得白色念珠菌感染对人类健康 产生更大的威胁。为了发现和开发低毒性和高治疗 活性的新型抗真菌剂，专家们试图从天然产物（植 物，动物，微生物）中寻找。例如植物来源的姜黄 素 ，厚朴酚 ，和厚朴酚 ，柠檬烯 等对白色念 珠菌生物膜的形成具有较好的抑制作用；动物来源的蛙皮抗菌肽- S1 可抑制白色念珠菌生物膜的形 成 ；微生物来源的土壤链霉菌菌株 98％乙醇提取 物 ，冠霉素链霉菌 ADP4 乙酸乙酯粗提取物 、海 洋 细 菌 枯 草 芽 孢 杆 菌 的 5 - 羟 甲 基 - 2 - 糠 醛 （5HM2F） 、粪肠球菌细菌素 EntV 等对白色念珠 菌的生物膜也具有较好的抑制效果。天然衍生的化 学抗真菌剂是一种有吸引力的选择，特别是那些微 生物衍生的分子，由于它们对机体的刺激性小，毒性 小，同时也不易使病原菌发现采取防护措施。目前 开发的大部分抗生素都源于放线菌，它被广泛认为 是新抗生素产生菌群的重要菌种，是开发价值相当 高的一类微生物。



 

免责声明：文章仅供学习和交流，如涉及作品版权问题需要我方删除，请联系我们，我们会在第一时间进行处理。