浅谈杭白菊叶枯病病原菌鉴定过程

杭白菊 Dendranthema morifolium 又名白菊花， 是享有盛誉的“浙八味”中药植物之一。浙江省桐乡 市从明末开始就种植栽培白菊花，至今已有几百年 的种植历史，为国家原产地保护的特产，2015 年总 种植面积为3 000 hm2 ，产量为0.91万t，约占全国总 产量的60%，是当地优势特色农业产业和农民增收 致富的重要经济来源（沈瑶等，2017）。随着杭白菊 产业的发展，因农药残留引起的质量安全问题逐渐 暴露出来，已成为制约该产业持续健康发展的关键因子之一。

供试病样及植物：2015—2016年从浙江省桐乡 市采集具有典型叶枯病症状的现蕾期杭白菊植株用 于病原菌的分离鉴定及后续抗药性测定；同时于浙 江农林大学东湖校区农作园内种植健康的杭白菊， 用于测定分离病原菌的致病性。 供试药剂及培养基：98%多菌灵（carbendazim） 原药，浙江威尔达化工有限公司。马铃薯葡萄糖琼 脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：马铃薯200 g、 葡萄糖20 g、琼脂20 g，蒸馏水定容至1 L；燕麦片煎 液琼脂（oat meal agar，OMA）培养基：燕麦片 30 g、 琼脂粉18 g，蒸馏水定容至1 L。 试剂及仪器：PCR扩增试剂盒2×Taq PCR Mix、 DNA提取试剂盒、SanPrep柱式PCR产物纯化试剂 盒（SK8142），生工生物工程（上海）股份有限公司； 其余试剂均为国产分析纯。PHSJ-3F型pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；MJ-150I 型霉菌培养 箱，上海一恒科学仪器有限公司；ABI2720 PCR仪， 美国Bio-Rad公司；Scope. A1型光学显微镜，德国卡 尔·蔡司公司。

于 2015—2016 年对浙江省桐乡市杭白菊生产 基地的叶枯病进行了调查，将采集得到的32份病叶 样品分别装于无菌密封袋中带回实验室。选取有典 型病斑的叶片，在病健交界处切取5 mm×5 mm大小 的组织块，在75%乙醇中浸泡消毒5 s后用无菌水连 续漂洗3次，再用1%次氯酸钠浸泡1 min后用无菌 水浸洗3次，放在灭菌滤纸上晾干后置于PDA平板 上。于 25℃恒温黑暗培养 3 d 后，挑取菌落边缘的 菌丝进行纯化培养，对分离所得的菌株进行编号并 于PDA斜面保存。

从 1.2.1 中分离保存的菌株中随机选择 2 株菌 株，在PDA培养基上进行活化，25℃下黑暗培养7 d 后，用直径 5 mm 的打孔器在菌落边缘打取菌饼。 将健康无病且大小一致的现蕾期杭白菊叶片用无菌 水冲洗晾干后，再用无菌针头刺伤叶片表面后将病 原菌菌饼接种至伤口处，置于 25℃、光照条件为 12 L∶12 D的培养箱中保湿培养3 d，记录发病情况。 以接种无菌PDA培养基作为对照，每个处理3次重 复。基于柯赫氏法则对接种3 d后发病叶片进行病 原菌的再分离及纯化，并与原接种菌株进行比对。

将纯化后的菌株分别接种至PDA和OMA平板 上，25℃下黑暗培养 6 d 后，再置于温度为 25℃、光 照条件为12 L∶12 D的培养箱中培养5 d后，分别观 察并拍照记录平板上的菌落生长形态及颜色，并在 显微镜下观察病原菌的产孢结构和分生孢子形态特 征。每株菌株随机观察10个视野，每个视野20个分 生孢子，共测量200个分生孢子的大小，以de Gruyter et al（. 1993）和Xu et al（. 2016）的标准作为分类鉴定 的形态学依据。

对32份具有典型病斑的杭白菊叶片样品进行病原菌分离，共纯化获得 35 株菌株，依据病害“叶 枯”拼音缩写YK+采样地点拼音缩写+序号的原则 对其进行命名，采样地点包括缘缘菊业基地、李庄、 李家桥、颜井桥、港北、绕城路口、官楼，其拼音缩写 分别简写为YY、LZ、LJQ、YJQ、GB、RC、GL，无地点 编号的菌株均为桐乡市区采集分离所得。随机以YK-YJQ-10和YK-LJQ-3作为代表菌株 进行致病性试验。结果显示，健康杭白菊叶片在回 接YK-YJQ-10和YK-LJQ-3菌株5 d后，叶片出现深 褐色圆形病斑，呈水渍状，7 d后病斑继续扩大，连成 大病斑，叶片枯萎，而对照杭白菊的叶片只 出现褪绿，并无病斑。上述症状与采集到的 杭白菊田间自然发病症状一致。对病变 组织再次进行病原菌的分离、纯化，得到与接种菌株 YK-YJQ-10和YK-LJQ-3相同的病原真菌。满足柯 赫氏法则，证实分离获得的菌株确为杭白菊叶枯病 的病原菌。

叶枯病是影响杭白菊产量的主要叶片病害，本研究从浙江省桐乡市采集得到具有典型叶枯病症状 的样品，通过病害症状的系统观察，病原菌的分离、 纯化和致病性测定，结合病原菌的形态学特征和分 子系统发育分析结果，确定引起杭白菊叶枯病的病 原菌是茎点霉属的 P. bellidis。该病原菌常侵染白 芷、雏菊、荸荠等植物，严重影响作物的产量和品质 （Lv et al.，2011；Xu et al.，2016）。而普通菊花上的 黑斑病是由壳针孢属真菌菊壳针孢菌引起的（杨文 成，1996；张春桃等，2010）。说明杭白菊上病害的病 原菌及发生流行规律很可能与普通菊花存在一定差 异。王呈辉等（2015）曾报道自浙江省磐安县杭白菊叶枯病病叶中分离到的病原菌为尖孢镰孢菌Fusarium oxysporum，病害症状主要为变色：叶片先端变 黄，再由局部扩展到整个叶缘，呈褐色至红褐色的叶 缘病斑；其后病斑逐渐向叶片基部蔓延，直至整个叶 片变为褐色或灰褐色。

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