用一恒培养箱对枯草杆菌芽孢皮层裂解酶的分析

1 材料与方法 

1． 1 材料与试剂 

1． 1． 1 主要试剂 

Protein Marker: Thermo 公司; 异 丙基硫代-β-D-半乳糖苷( IPTG) 、Tris: 购自 Sigma 公 司; SDS: Amresco 公司; TEMED: BIO-ＲAD 公司; 胰 蛋白胨( Tryptone) 、酵母提取物( Yeast Extract) : OXOID 公司; 琼脂粉、分析纯氯化钠( NaCl) 购自北京 化学试剂公司; DNA marker: TaKaＲa 公司; 普通质粒 小提试剂盒、PCＲ 回收试剂盒( Wizard SV Gel and PCＲ Clean-U system) : 天根生化科技( 北京) 有限公 司; Amp( 氨苄青霉素) : 上海求德生物化工; 30 % 丙 烯酰胺溶液: 北京雷根生物科技有限公司; pH 8． 8 的 4 × Tris/SDS 分离胶缓冲液、pH 6． 8 的 4 × Tris/ SDS 浓缩胶缓冲液: 上海双螺旋生物科技有限公司; 10 % 过硫酸铵溶液、TEMED、甘氨酸: 北京博奥拓达 科技有限公司。 

1． 1． 2 菌种 

pCZN 1 质粒、TOP10 菌株、Arctic-Express TM( DE3) 表达菌均来自于南京钟鼎生物技术 有限公司。 

1． 1． 3 仪器与设备 

AL204 型电子天平: 梅特勒 － 托利多仪器( 上海) 有限公司; DSX-280B 型高压灭 菌锅: 上海申安医疗器械厂; LＲH 系列生化培养箱:上海一恒科学仪器有限公司; GL-10C 型冷冻离心 机: 上海安亭科学仪器厂; 722 型可见分光光度计: 上海驰唐电子有限公司; DYCZ-24DN 型电泳槽: 北 京六一生物科技有限公司; GE AKTA Pure 蛋白质层析纯化系统: 美国通用电气有限公司; DYY-6C 型电 泳仪电源: 北京市六一仪器厂; JY92-2D 超声波细胞 粉碎机: 中国新芝科器研究所; SIM-F140AY65-PC 型 雪花状制冰机: 日本 SANYO 公司; SW-CJ-1D 型超 净工作台: 中国苏净集团。

2 结果与分析 

2． 1 CwlJ 基因的克隆与重组质粒的构建 

通过 PAS 法，两步 PCＲ 合成目的基因 CwlJ，所 得产物经 1 % 琼脂糖凝胶电泳分析检测，结果显示 在 Marker 为 500 bp 处有一清晰条带，目的条带上方 出现的阴影可能是引物不特异或者退火温度不合理 等原因。将 CwlJ 基因的 PCＲ 合成片段连接到载体 上，获得重组质粒 pCZN 1-CwlJ。该质粒经 NdeI 和 XbaI 双酶切鉴定，很明显该列有 2 条条带，其 中一个条带大于 3000 bp，符合载体大小; 另一个条 带在 500 bp 附近，符合目的条带大小，可初步断定 CwlJ 已经插入到质粒 pCZN 1 中。 

2． 2 重组菌菌液测序验证及序列比对 

按照 1． 2． 2 的方法合成了目的基因 CwlJ，转入 克隆菌株 TOP10 后挑取阳性克隆子进行测序，对测 序结果序列进行 OＲF( 开放阅读框) 查找，发 现 CwlJ 基因的克隆产物含有 1 个 462 bp 的开放阅 读框，编 码 153 个 氨 基 酸，蛋白理论分子量约为 17. 9 KDa。该结果同 蛋白数据库给出的皮层裂解酶 CwlJ 氨基酸序列比 对后相似性为 100 %。由此得出结论 pCZN 1-CwlJ 重组表达载体构建成功，可用于下一步目标 蛋白 CwlJ 的诱导表达。

3 讨 论 

构建了 pCZN 1-CwlJ 重组表达载体，建 立了高效表达皮层裂解酶 CwlJ 的基因工程菌，并成 功诱导重组皮层裂解酶 CwlJ 基因表达。虽然表达 产物为包涵体，但是仍然没有阻碍实验的进行，起初 包涵体确实没有活性，这是因为蛋白的错误折叠并 形成了不可溶性的蛋白聚集体，采用了一系列蛋白变复性方 法，最终成功纯化并获得有活性的皮层裂解酶CwlJ，为后期实验奠定了基础。

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