胎牛皮源高层级胶原聚集体的制备

前言

胶原材料凭借其优良的生物相容性和细胞亲和性，被广泛应用于组织工程和再生医学材料领 域。随着我国高新技术的发展，生物医用材料产量 不断增加，现已步入生物医学材料与组织工程技 术相结合的研发阶段。但材料的机械性能及单一 结构、繁琐的手术修复过程和高昂的手术费用，在 一定程度上限制了胶原基生物医用材料的医学应 用领域。临床应用发现，已有的人工皮肤或医用 胶原膜不能广泛用于大面积深度烧伤创面，易被 胶原酶消化降解，易引起结痂、炎症、瘢痕痉挛等问题。

1 试验部分

1.1 主要材料及仪器设备

胎牛皮脱细胞真皮基质 （四川大学生物质工 程研究所制），胃蛋白酶（陆良酶制剂厂），I 型胶原 酶（美国 Gibcobrl 公司），氯化钠、氢氧化钠、磷酸 二氢钠、磷酸氢二钠、冰醋酸（分析纯，成都市蜀都 化学试剂厂）。 高速离心机，LG10-24A，北京医用离心机厂； 恒温磁力搅拌器，84-1A，上海思乐仪器有限公司； 真空冷冻干燥机，Freeze6，Labonco 公司；原子力显 微镜，SPM-9600，日本 SHIMADZU 公司；傅立叶变 换红外光谱仪，200XSV-IR，美国 Nicolet；差式扫描 量热仪，DSC-200PC，德国耐驰。

1.2 胎牛皮高层级胶原聚集体的提取

取一定量的自制胎牛皮脱细胞真皮基质，裁 剪成 5.0 mm×5.0 mm 的组织小块，用超纯水清洗 3~5 次，浸泡在 0.9%的生理盐水中，磁力缓慢搅拌 2 h，过滤除去生理盐水；将材料在 10 mmol/L 的 Tris—NaCl 缓冲溶液（pH=7.0）中浸泡 2 h 后，反复 清洗、沥干；将沥干的材料浸渍在 pH 为 2.0~2.5 的 冰醋酸溶液中，低温连续搅拌至材料呈透明状，用 纱布过滤掉可溶性胶原；收集已膨胀组织块，加入 适量 0.5 mol/L 的醋酸溶液，适当搅拌后进行低温 组织匀浆，再用 pH=10 的 NaOH 溶液调节浆液 pH 值至 7.0，加入 NaCl 最终浓度为 1.5 mol/L，盐析至 浆液中有絮状沉淀；低温离心，收集下层沉淀，复 溶于醋酸溶液中，最后分别用 0.04 mol/L 和 0.02 mol/L 的 NaH2PO4 溶液各透析一天，蒸馏水透析两 天，冷冻干燥，即制得高层级胶原聚集体海绵。

1.3 胎牛皮胶原的提取

取一定量的自制胎牛皮脱细胞真皮基质，裁 剪成 5.0 mm×5.0 mm 的组织小块，用超纯水充 分清洗，浸泡在生理盐水中，磁力缓慢搅拌 2 h， 过滤除去生理盐水；将材料在 10 mmol/L 的 Tris— NaCl 缓冲溶液（pH=7.0）中浸泡 2 h 后，反复清洗、 沥干；将沥干的材料浸渍在 pH 为 2.0~2.5 的冰醋 酸溶液中，低温连续搅拌至材料呈透明状，用纱布 过滤掉可溶性胶原；收集已膨胀组织块，加入适量 的 0.5 mol/L 醋酸溶液，适当搅拌后，准确加入干 皮重的 2%的胃蛋白酶（1∶3000），并于 4 ℃下连续搅拌 24 h。过滤分离，取滤液，用 pH=10 的 NaOH 溶液调节浆液 pH 值至 7.0，加入 NaCl 最终 浓度为 1.5 mol/L，盐析至浆液中有絮状沉淀；低温 离心，收集下层沉淀，复溶于醋酸溶液中，最后分 别用 0.04 mol/L 和 0.02 mol/L 的 NaH2PO4 溶液各 透析一天，蒸馏水透析两天，最后冷冻干燥，制得 胶原海绵。

1.4 膜的制备

分别称取一定量 col 和 AG-col，充分搅拌溶解 在 0.5 mol/L 的醋酸溶液中，配制成 7 mg/mL 的样 品溶液，将样品溶液倒入聚四氟乙烯表面皿，在室 温条件下溶剂自然挥发成膜，备用。

1.5 样品表征

1.5.1 原子力显微镜（AFM）观察

取少量样品溶于 0.005 mol/L 的醋酸溶液中， 配制成浓度为 20 μg/mL 的样品液，用移液枪移取 7 μL，小心滴加在云母片上，室温下置于干燥器中 自然干燥 48 h。置于原子力显微镜样品台上，室温 下采用非接触 Tapping 模式进行观察。

1.5.2 傅里叶变化红外光谱（FTIR）分析

混合研磨样品和溴化钾，压成薄片后进行红 外光谱检测，扫描范围为 400~40 000 cm-1 ，分辨率 为 4 cm-1 ，重复扫描 32 次。

1.5.3 圆二色谱（CD）检测

将样品溶胀于 0.05 mol/L 的冰醋酸溶液中，配 制成浓度为 0.1 mg/mL 的样品液，4 ℃下静置脱 泡，测试前将样品液置于生物培养箱中 25 ℃下恒 温 1 h，25 ℃下使用圆二色谱仪进行测定，扫描波 长范围为 190~260 nm，采集速率为 20 nm/min。

1.5.4 差示扫描量热分析仪（DSC）检测

取样品 3~5 mg 置于 DSC 坩埚中，用空坩埚作 参比，用氮气作保护气，从 20 ℃加热到 180 ℃，升 温速度为 10 ℃/min。

1.5.5 动态热重（TG）检测

称取样品 3~5 mg，氮气作保护气，收集检测过 程中样品重量与温度的动态变化数据，绘制热重 TG 曲线和微商热重 DTG 曲线。设置升温范围为 50~600 ℃，升温速率为 10 ℃/min。

1.5.6 机械性能测试

将样品制成 50 mm× 5 mm 长条形状，采用拉 力机测定膜的拉伸强度和断裂伸长率。样品运行速率为 5 mm/min，每次测试取 4 个平行样，结果以 平均值和方差来表示。

1.5.7 酶降解性能检测

取大小为 1.5 cm×1.5 cm 的 col 膜和 AG-col 膜，称重，记录为 m0，加入 5 mL 浓度为 3 U/mL 的 I 型胶原酶磷酸盐缓冲液(pH=7.4)，(37±0.5)℃恒温 水浴振荡。分别在 2、4、6、8、10、12、24 h 取样。样 品经蒸馏水水洗 5~6 次，冷冻干燥至恒量，称量， 计为 m1。膜材料的酶降解性通过降解前后样品质 量的减少比例来计算。


2 结果与讨论

AFM 能够观察生物样品的三维结构形貌。为胎牛皮 col 的 AFM 三维表象和高度检测图，从 图中可以观察到胶原分子间相互交织缠绕，形成 了具有均一孔隙的三维网状立体结构；胶原分子 直径（约为 14 nm）较为均一，且基本排列在同一高 度。为胎牛皮 AG-col 的 AFM 三维表象和高 度检测图，可以看出 AG-col 直径分布较宽，从 80 nm 到 350 nm 不等，纤维排列取向性不明显，高度 相差很大，可推测 AG-col 是由胶原纤维束或胶原 纤维编织缠结而成的三维网状立体结构。由此，我们不难得出结论：胶原聚集体的三螺 旋结构是由更多的分子间与分子内氢键维持高层 级结构的稳定性的，其分子间交联结构更加稳定。 胎牛皮胶原因其稳定的分子间化学键含量较低， 且可能在很大程度上含未交联的三螺旋结构，其 结构稳定性较低。

3 结论

以实验室自制 FB-ADM 为原料，采用自主设 计的可控降解技术制备出基于胶原分子的 AG-col。通过 AFM、FT-IR、CD 检测等手段对 col 和 AG-col 的结构进行表征，结果表明：二者红外 特征吸收峰明显，天然的三股螺旋结构完整； AG-col 的结构层次更高级，交联结构更加稳定。通 过 DSC、TG、拉伸测试、耐酶降解性能检测等手段 对胶原和胶原聚集体的性能进行表征，结果表明： AG-co 的热稳定性（耐热破坏性和抗热分解能力） 更好，可耐受较高温度的交联改性或深度加工，拓 宽了胶原在胶原基生物医用材料领域的应用范 围；胶原聚集体基膜材料的强度、柔韧性和耐酶降 解性能较胶原基膜材料也更加优越，这将为改善 胶原基生物膜材料的机械性能和耐酶降解性能提 供很好的原料基础。同时，在一定程度上，可为解 决脱细胞真皮基质可塑性差、细胞生长空间有限、 伤患二次创伤等问题提供新的思路。