优化饲用粪肠球菌发酵培养基-一恒培养箱使用

抗生素作为添加剂在畜禽养殖中长期使用导致耐 药菌株产生，胃肠道正常菌群失调，引起动物内源性 感染或二重性感染，严重影响养殖业持续发展。 利用无毒害及兼性厌氧菌的粪肠球菌 ( Enterococcusfaecalis) 等益生菌制成饲用微生态制剂，能够对致病 菌起抑制作用，调节动物肠道平衡，减少多种消化道 疾病的发病率，有助于畜禽生长，且无毒无耐药性， 有望代替抗生素在饲料中的添加。但乳酸菌微生 态制剂在肠道中是需要一定数量的活性微生物的才起 到调节肠道菌群平衡作用。因此提高产品中活性 微生物的含量对发挥其益生作用至关重要。

1 材料与方法

1. 1 材料与仪器

粪肠球菌 EXW 27 由江西省科学院微生物研究所 南昌市应用微生物重点实验室从健康仔猪肠道黏膜上 分离纯化的优势菌株，体外试验证明，该菌株对于畜 禽具有优良的益生潜力。 MＲS 培养基: 蛋白胨 10. 0 g、牛肉膏 10. 0 g、酵 母粉 5. 0 g、葡萄糖 20. 0 g、吐温 80 1. 0 mL、磷酸氢 二钾 2. 0 g、乙酸钠 5. 0 g、柠檬酸氢二铵 2. 0 g、硫 酸镁 0. 68 g、硫酸锰 0. 25 g，将上述成分加入到 1 000 mL 蒸馏水中，加热溶解，调节 pH 值为 6. 5， 121 ℃灭菌 15 min，需要时加入 15 g 琼脂。配制液体 和固体 MＲS 培养基，分别使用于活化菌种及其活菌 计数。 胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉膏、酵母粉 ( 安琪酵 母股份有限公司) ; 麦芽糖、糊精、玉米浆 ( 北京索 莱宝科技有限公司) ; 氨基酸、维生素 ( 生工生物工程有限公司) 。 电子分析天平 MP5002 ( 上海舜宇恒平科学仪器 有限公司) ，生化培养箱 LＲH-250 ( 上海一恒科学仪器有限公司) 。

1. 2 方法

1. 2. 1 培养方法

菌种活化: 将本实验室保存的菌种粪肠球菌 EXW27在培养基上划线接种至斜面 MＲS 培养基上活 化，37 ℃恒温培养 24 h，传代 2 次。从保藏斜面挑 1 环菌苔接于装有 100 mL 液体 MＲS 培养基的 250 mL 三角瓶中，于 37 ℃、120 r/min 培养 12 h。 摇瓶发酵培养: 按 3%的接种量将种子液接入到 装有 200 mL 不同试验培养基的 500 mL 三角瓶中，37 ℃、180 r/min 培养 18 h 后进行活菌计数，计数方法 采用固体 MＲS 倾注法。

1. 2. 2 单因素试验

碳源的优化: 在 MＲS 培养基的基础上，选择不 同的碳源代替其中的葡萄糖进行优化试验。所选的碳源包括葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、糖 蜜、可溶性淀粉、低聚异麦芽糖、乳清粉和糊精。最 佳碳源选定后，按照 2. 0%、3. 0%、4. 0%、5. 0%和 6. 0%的添加量考察对粪肠球菌生物量的影响。

1. 2. 3 PB 试验设计

PB 试验设计通过比较每个影响因素 2 个水平的 差异以及整体的差异，分析每个因素的显著性，从而 达到快速准确筛选出显著影响因子的目的。以粪肠球 菌培养液的活菌浓度作为响应值，筛选出对粪肠球菌 活菌数影响显著的因素。选用试验次数 N = 12 的 PB 设计，根据单因素试验结果，确定蔗糖 ( A) 、蛋白 胨 ( B) 、磷酸二氢钾 ( C) 、柠檬酸铵 ( D) 、乙酸钠 ( E) 、硫酸镁 ( F) 、硫酸锰 ( G) 、组氨酸 ( H) 、维 生素 C ( J) 、碳酸钙 ( K) 这 10 个因素为 PB 试验的 考察对象。

2 结果与分析

由表 1 可知，以葡萄糖、蔗糖为的碳源时，菌体 的生长情况明显优于其他碳源，蔗糖作为碳源时比葡 萄糖为碳源时发酵液的活菌数略低，差距不大，考虑 到碳源的稳定性和原料成本，选择蔗糖作为碳源。蔗 糖质量分数优化结果表明该粪肠球菌耐糖性较好，但 蔗糖浓度过高，会因渗透压过高而抑制菌体的生长， 选择蔗糖的添加量为 4%。氮源为蛋白胨按 3%添加 量时活菌浓度最大。由于 Mn2+ 作为乳酸脱氢酶的组 成成分，硫酸锰的最适添加量为 0. 3 g /L，活菌浓度 比对照组提高 18. 2%; 糖酵解的大部分过程中都以 Mg2+ 为辅助因子，当硫酸镁添加量为 1 g /L，活菌浓 度比对照组提高 11. 6%。从结果中可发现具有缓冲 体系的培养基中的生物量明显较高，不同缓冲体系之 间以及同一缓冲体系不同浓度之间的差异显著，其中 柠檬酸铵/乙酸钠/KH2PO4 缓冲体系最适于粪肠球菌 的生长。


3 讨论

碳源不仅为微生物菌体生长繁殖提供所需的能 源，还为菌体合成提供碳骨架。菌体在利用不同碳源 时会产生不同的酶系，并对发酵代谢产物的产生不 同，从而不同的菌株对碳源的偏好不同。氮源 主要用于构成菌体细胞和合成含氮代谢产物。无机氮 为微生物生长的速效氮源，但不利于粪肠球菌的生 长，菌体活菌含量较低; 有机氮源要优于无机氮源， 主要因为有机氮源含有丰富的氨基酸和小肽易被吸 收，在细胞内直接被利用参与蛋白质的合成，还含有 多种维生素及生长因子，更利于粪肠球菌的生长。 微量元素是酶的激活剂或生物活性物质的组成成分， 对乳酸菌生长的促进作用明显。在培养基中添加 缓冲盐，既可调节细胞内的渗透压，又可缓解代谢产 物乳酸造成的低 pH 对菌体生长的抑制作用。