一恒恒温培养箱对肺癌细胞的机制研究

非小细胞肺癌是我国发病率和死亡率最高的 恶性肿瘤，严重威胁人类健康。手术治疗是目前 治疗早期非小细胞肺癌最有效的手段，但由于肺癌的早期症状不明显，很大一部分患者在确诊非 小细胞肺癌时已发生转移。对于这些患者而言， 系统性化疗是不可或缺的治疗方案。

1 材料

1.1 细胞培养

人非小细胞肺癌细胞系 A549 购于美国模式 培养物保存中心(ATCC)，培养在含 10%胎牛血清 的 DMEM 培养基中，在 37 ℃恒温恒湿培养箱（上海一恒LHS-50CH恒温恒湿培养箱）中培养 并通入 5% CO2。细胞每 2~3 d 传代 1 次，传代时， 用胰酶消化液使细胞进入悬浮状态，并用 DMEM 培养基洗涤 2 次，将细胞悬液按 1∶3 稀释后传代。

1.2 试剂

顺铂、卡铂、奥沙利铂、噻唑蓝(MTT)和凋亡 检测试剂盒购于德国 Sigma-Aldrich(批号分别为 C221000，1096407，O9512，M2128，APOAF)； YM-155(美国 Med Chem Express 公司，批号： HY-10194)；DMEM 培养基(美国 Gibco，批号： 10569044)；蛋白提取液、survivin、细胞色素 C、 凋亡诱导因子、caspase-9、caspase-3 和 GAPDH 抗体购于美国 Cell Signaling(货号分别为#9806， #2808，#4280，#5318，#9502，#9665，#5174)； 线粒体分离试剂盒和 JC-1 购于碧云天生物科技有 限公司(批号：C3601，C2005)；ECL 显色试剂盒(美 国 Pierce，批号：32106)；Lipofectamine 2000(美 国 Invitrogen，批号：11668019)。survivin 小干扰 RNA(美国 Santa Cruze 公司，批号：SC-29499)。

2 方法

2.1 survivin 强制过表达与基因沉默

将 survivin 基因的开放阅读框架序列经 PCR 扩增后，以分子克隆的方法与 pcDNA3.1 连接后构 建成 survivin 重组质粒，用于在 A549 细胞进行 survivin 的强制过表达。survivin siRNA 则用于 survivin 的基因沉默。A549 细胞接种在 6 孔板中 孵育过夜使之贴壁。将 survivin 重组质粒(终浓度为 2 μg·mL) 或 survivin siRNA( 终浓度为 50 pmol·mL)用 Lipofectamine 2000 进行包裹后， 将其加入到无血清培养基进行混合。将贴壁的 A549 细胞置于该无血清培养基孵育 6 h，之后弃 去无血清培养基加入新鲜的含 10%胎牛血清的 DMEM 培养基中培养 24 h。收集细胞用于后续实 验。对照细胞为 Lipofectamine 2000(含空质粒，终 浓度为 2 μg·mL)，孵育 6 h。

2.2 细胞活力、半抑制浓度(IC50)与两药联合指数 (combination index，CI)检测

将 A549 细胞按每孔 5×103 接种在 96 孔板上， 孵育过夜，使之贴壁。在培养基中加入顺铂 (0~30 mol·L) 和 YM-155(0~80 nmol·L) 处 理 A549 细胞 48 h。之后在每个培养孔中加入 0.1 mg MTT，并将细胞继续置于 37 ℃恒温培养箱中培养 4 h。小心吸走孔内培养基，加入 100 L 二甲亚砜， 充分震荡混匀后在 570 nm 波长下测定吸光度(A) 值。细胞活力结果用药物处理组与对照组的 A 值 比值表示。绘制细胞活力-顺铂浓度曲线，根据曲 线计算顺铂对 A549 细胞的 IC50。CI 用以下公式判 断：CI=E(A+B)/(EA+EBEA×EB)，其中 E(A+B) 为合并用药抑制率，EA 和 EB 分别为顺铂和 YM-155 的抑制率。CI 在 0.85~1.15 内为两药作用 单纯相加，CI>1.15 为协同作用，CI<0.85 为拮抗 作用。药物抑制率=(A 对照组A 药物处理组)/A 对照组×100%。

3 结果

将非小细胞肺癌细胞系 A549 用 YM-155 (0~80 nmol·L)进行单独处理，MTT 试验结果显 示，10 nmol·L YM-155 单独处理仅能轻微抑制 A549 细胞的细胞活力。因此将 A549 细胞用 10 nmol·L的 YM-155 与不同浓度顺铂进行联合 处理，研究 YM-155 是否能增强顺铂的抗肺癌活 性。实验结果显示，YM-155 10 nmol·L联合处理 能显著提高不同浓度顺铂(1~30 mol·L)对非小 细胞肺癌细胞系 A549 的杀伤活性。根据细胞活力 -顺铂浓度曲线计算顺铂对 A549 的 IC50，结果发 现 YM-155(10 nmol·L)协同处理能明显降低顺铂 对 A549 细胞的 IC50，结果见图 1。另外，将 A549 用顺铂(1~20 mol·L)和 YM-155 (5~100 nmol·L) (顺铂∶YM-155=200∶1)进行联合处理，计算 CI 值，结果显示顺铂和 YM-155 存在协同抗非小细胞 肺癌活性，见表 1。

Western blot 试验结果显示，YM-155 能明显 抑制 A549 细胞中 survivin 的表达水平，表明 survivin 是 YM-155 的作用靶点。另外，为了研究 survivin 对顺铂杀伤非小细胞肺癌活性的影响，将 survivin 表达质粒或 survivin siRNA 转染入 A549 细胞中，观察其效果，survivin 质粒和 survivin siRNA 的转染效率。MTT 试验结果显示， YM-155 能显著提高顺铂对 A549 细胞的杀伤活性， 然而转染 survivin 表达质粒后，YM-155 对顺铂抗 肺癌活性的增强作用受到明显抑制。另一方面， 转染 survivin siRNA 直接抑制 survivin 的表达水平 同样能增强顺铂对 A549 细胞的毒性。同时，在 YM-155 处理的 A549 细胞中转染 survivin siRNA 能进一步增强顺铂对 A549 细胞的毒性。这些结果 表明 survivin 对顺铂的抗肺癌活性起重要作用， YM-155 是通过抑制 A549 细胞中 survivin 的表达 提高其对顺铂的敏感性。

4 讨论

YM-155 是一种 survivin 特异性抑制剂，临床 试验和基础实验表明 YM-155 是一种潜在的抗肿 瘤协同治疗药物，对多西他奇、美罗华、雷帕霉 素等抗肿瘤药物的疗效都有增效作用。然而， YM-155 如何增强化疗药物的疗效，其下游机制 如何，目前仍不清楚。另外，尽管顺铂是治疗非 小细胞肺癌的一线药物，然而顺铂对患者的不良 反应也较大，因此采取协同治疗手段降低顺铂的 使用剂量并提高其疗效是目前肺癌化疗的重要策略。



 

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