上海一恒摇床使用于细胞中转运特性的研究

芹菜素（ａｐｉｇｅｎｉｎ）又称芹黄素，化学名为４′，５， ７－三羟基黄 酮（４′，５，７－ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｆｌａｖｏｎｅ），是 芹 菜 中黄酮类化合物的主要成分，也是其发挥生理功效 的主要活性物质。芹菜素在高亲水性和非极性溶 剂中的溶解性差，几乎不溶于水，可溶于热乙醇、二 甲基亚砜（ＤＭＳＯ）和稀 ＫＯＨ 溶液。目前对芹菜 素的研究主要集中在提取工艺、检测方法及药理作 用等方面。

Ａｎｇｉｌｅｎｔ１２２０ＬＣ型高效液相色谱仪（美 国 Ａｇｌｉｅｎｔ公司），ＸＳ１０５型电子天平（德国梅特勒－托 利多公司），ＴＤＬ－４０Ｂ型高速冷冻离心机（上海安亭科 学仪 器 厂），超 净 工 作 台（苏 州 净 化 设 备 总 厂），ＣＯ－ １５０型二氧化碳孵箱（美国 ＮＢＳ公司），THZ-100型 恒温摇床（上海一恒科学仪器有限公司），ＭＸ６Ｒ 型 倒置 显 微 镜 （宁 波 舜 宇 仪 器 有 限 公 司），Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ－ ＥＲＳ型电位 仪（美 国 Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公 司），ｐＨＳ－３ 型 精 密ｐＨ 计（上 海 精 科 雷 磁 仪 器 厂），ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０ 型酶标仪（美国 ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ公司）。

芹 菜 素 对 照 品（上 海 谷 研 实 业 有 限 公 司，批号：１５０６２３，纯 度≥９８％），ＤＭＥＭ 培 养 基（美 国 Ｈｙｃｌｏｎｅ公 司，批 号 １１９９５－０６５），非 必 需 氨 基 酸 （美国 Ｈｙｃｌｏｎｅ公司，批号ＳＨ３０２３８．０１），青霉素－链 霉素双抗 液（美 国 Ｈｙｃｌｏｎｅ公 司，批 号 ＳＶ３００１０）， 胰蛋 白 酶 （美 国 Ｈｙｃｌｏｎｅ 公 司，批 号 ２５２０００５６）， Ｈａｎｋ＇ｓ平衡 盐 溶 液（ＨＢＳＳ，美 国 Ｈｙｃｌｏｎｅ公 司，批 号ＳＨ３００１６．０７），ＰＢＳ缓冲液（美 国 Ｈｙｃｌｏｎｅ公 司， 批号ＳＨ３０２５６．０１Ｂ），ＥｘＣｅｌｌ胎 牛 血 清 （澳 大 利 亚 ＥｘＣｅｌｌ公司，批号 ＦＮＤ５００），维拉帕米（中国食品药 品检定研究院，批号１００２２３－２００１０２），环孢菌素 Ａ （中国食品药品检定研究院，批号１３０４９５－２０１３０３）， 二甲基亚砜（ＤＭＳＯ 分析纯，美国Ｓｉｇｍａ公司，批号 ＷＸＢＢ７１００Ｖ），甲醇、乙腈（色谱纯，美国ＦｉｓｈｅｒＳｃｉ－ ｅｎｔｉｆｉｃ公司），超纯水（实验室自制）。

Ｃａｃｏ－２细胞株传代数在２０～４０代内 （武汉博士德生物工程有限公司，批号 ＣＸ００６４）。

将 Ｃａｃｏ－２细 胞 培 养 于 １０％ ＤＭＥＭ 高 糖 培 养 液 （含 １０％ ＦＢＳ，１％青霉素－链霉素，１％非必需氨基酸等） 中，在５％ ＣＯ２，３７℃培养箱中培养至细胞对数生长期后用胰酶 消 化，１０％ ＤＭＥＭ 混 悬 后 调 整 细 胞 密 度为２×１０５ 个／ｍＬ，接种 于 Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ１２孔 板（聚 碳酯膜将每孔分为上下 两 侧 室，上 侧 室 ＡＰ 侧 是 肠 腔侧，下侧室 ＢＬ侧是基底侧）培养，连续培养２１ｄ， 测 量 跨 膜 电 阻 值 （ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｖａｌｕｅｓ，ＴＥＥＲ）。

采用 ＭＴＴ 法，将 Ｃａｃｏ－２细胞以每 孔５×１０４ 个／ｍＬ 的 细 胞 密 度接种 于 ９６ 孔 板，５％ ＣＯ２、３７℃ 条 件 培 养 ２４ｈ。 对照组（细胞加入２００μＬ１０％的 ＤＭＥＭ 高糖培养 液），实验组（ＨＢＳＳ溶液稀释制备芹菜素系列浓度工 作 液：０．５０、５．００、１５．００、２５．００、５０．００、１００．００、２００．００、 ４００．００μｇ／ｍＬ，每 个 浓 度 设 置６个 复 孔，各 实 验 组 细胞分别加入不同浓度芹菜素工作液２００μＬ），空 白组（作调零孔，培养基，孵 育２４ｈ后，各 组 细 胞 分 别加入５ｍｇ／ｍＬ的 ＭＴＴ 试剂２０μＬ，孵育４ｈ后， 弃去溶液，再加入１５０μＬＤＭＳＯ 溶解残留的 ＭＴＴ 甲臜 结 晶，震 荡 混 匀，测 定 ５７０ｎｍ 处 的 吸 光 度 （ＯＤ）值，计算细胞存活率，细 胞 存 活 率＝（ＯＤ实 验 组 －ＯＤ空 白 组 ）／（ＯＤ对 照 组 －ＯＤ空 白 组 ）。

取 Ｃａｃｏ－２细胞单 层 模 型 用 ＨＢＳＳ缓 冲 液（３７℃）荡 洗３次，加入 ＨＢＳＳ缓 冲 液，孵 育２０ ｍｉｎ，弃 上 清， 立即开始双向转运试验。考察顶侧（ＡＰ侧）→基底 侧（ＢＬ侧）转运，在 ＡＰ侧分别加入０．５ｍＬ含药ＰＢＳ 液，作为供试液，ＢＬ侧加入空白ＰＢＳ液１．５ｍＬ，置恒 温摇床（３７℃，４０ｒ／ｍｉｎ）中 孵 育，于 １５、３０、４５、６０、 ９０、１２０、１５０、１８０ｍｉｎ时从 ＢＬ 侧吸取２００μＬ 溶液 作为供试品，同 时 补 加２００μＬ 空 白 ＰＢＳ液。考 察 ＢＬ侧→ＡＰ侧转运时，在 ＢＬ侧分别加入１．５ｍＬ含 不同浓度不同药物的 ＰＢＳ液 作 为 供 试 液，ＡＰ 侧 加 入空 白 ＰＢＳ 溶 液 ０．５ ｍＬ，置 于 恒 温 摇 床 （３７℃， ４０ｒ／ｍｉｎ）中 孵 育，分 别 在 １５、３０、４５、６０、９０、１２０、 １５０、１８０ｍｉｎ时从 ＡＰ侧吸取２００μＬ溶液作为供试 品，同时补加２００μＬ 空 白 ＰＢＳ液。吸 取 的 供 试 品 均按已建立方法进行前处理，采用 ＨＰＬＣ法测定含 量，计算表观渗透系数Ｐａｐｐ，Ｐａｐｐ＝ｄＱ／ｄｔ×Ａ×Ｃ０， 式中ｄＱ 为ｄｔ内的转运量，Ａ 为１２孔板表膜面积， Ｃ０ 为供给室的初始质量浓度），外排比值 ＲＢ－Ａ／Ａ－Ｂ＝ （Ｐａｐｐ（Ａ－Ｂ／Ｂ－Ａ）／Ｐａｐｐ（Ｂ－Ａ／Ａ－Ｂ））。

Ｃａｃｏ－２细胞单层细 胞 ＴＥＥＲ值＞５００Ω／ｃｍ２，检测标志物荧光素钠通 透性的表观渗透系数 Ｐａｐｐ ＝（８．２７±１．３１）×１０－７ ｃｍ／ｓ，当 ＴＥＥＲ＞３００Ω／ｃｍ２，Ｐａｐｐ＜１０－６ｃｍ／ｓ，表明 单层细胞的紧密性和完整性良好，建立的 Ｃａｃｏ－２细 胞模型符合细胞转运实验的要求。当 芹 菜 素 浓 度 ＜ ２００．００μｇ／ｍＬ时，Ｃａｃｏ－２细 胞 存 活 率 均＞８５％，确 定芹菜素安全浓度范围为２００．００μｇ／ｍＬ 以 内，进 行双向转运。随着孵 育 时 间 的 增 加，高、中、低浓度芹菜素在 Ｃａｃｏ－２细胞中双 向 转 运 的 Ｑｒ值 均 增 加，其 中 中 浓 度芹菜素双向转运的 Ｑｒ值高于高、低浓度，差异有 统计学意义 （Ｐ ＜０．０５）。芹菜素双侧Ｐａｐｐ值均随着 浓度的增加而减少，不同浓度间Ｐａｐｐ值的比较，差异 有统计学意义 （Ｐ ＜０．０１）。高、中浓度芹菜素 ＡＰ－ ＢＬ侧Ｐａｐｐ值高于ＢＬ－ＡＰ侧，差异有统计学意义 （Ｐ ＜０．０５）。高、中、低 浓 度 芹 菜 素 的 ＲＢ－Ａ／Ａ－Ｂ值 均 ＜ １．５，见表１。

３ 讨论

Ｃａｃｏ－２细胞来源于人的结肠癌细胞，其结构特 性和生化作用类似于小肠上皮细胞，可作为研究药 物体外肠吸收机制及相互作用的分子筛选工具，同 源性较好。以 细 胞 毒 性 试 验 ＭＴＴ 比 色 法 检 测 Ｃａｃｏ－２细胞的存活和生长，琥珀酸脱氢酶存在于受 损伤的活细胞 线 粒 体 中，能 还 原 外 源 性 的 ＭＴＴ 成 蓝紫色结 晶 甲 瓒（Ｆｏｒｍａｚａｎ），死 细 胞 无 此 功 能，该 法操作简便、重复性好。药物在小肠的吸收情况 可用 Ｃａｃｏ－２单层细胞模型的表观渗透系数 Ｐａｐｐ值 评价，通常人体吸收较完全的药物Ｐａｐｐ＞１０－４ｃｍ／ｓ， 而吸收差的药物（吸收＜１％）的Ｐａｐｐ＜１０－７ｃｍ／ｓ。 在 Ｃａｃｏ－２细胞 中 通 常 用 Ｐａｐｐ（ＡＰ－ＢＬ）与 Ｐａｐｐ（ＢＬ－ ＡＰ）的比值表示外排比率 ＲＢ－Ａ／Ａ－Ｂ，其可作为评价药 物转运特性的指标。如果药物主要被小肠顶侧膜的 转运载体所摄取，ＡＰ侧到 ＢＬ侧的 Ｐａｐｐ值应明显大 于 ＢＬ侧到 ＡＰ侧 的 Ｐａｐｐ值，则 ＲＢ－Ａ／Ａ－Ｂ值＜１；如 果 药物转运主要以被动扩散形式完成，ＡＰ侧到 ＢＬ侧 的Ｐａｐｐ值 与 ＢＬ 侧 到 ＡＰ 侧 的 Ｐａｐｐ 值 应 该 相 当， ＲＢ－Ａ／Ａ－Ｂ值接近于１；如 果 药 物 被 小 肠 顶 侧 膜 的 转 运 蛋白分泌或 外 排，存 在 主 动 转 运 机 制，转 运 有 方 向 性，ＢＬ 侧 到 ＡＰ 侧 的 Ｐａｐｐ值 会 远 远 大 于 ＡＰ 侧 到 ＢＬ侧 的 Ｐａｐｐ值，则 ＲＢ－Ａ／Ａ－Ｂ值＞１．５。



 

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