生化培养箱在氧氟沙星无菌方法学研究的使用

注射用甲磺酸左氧氟沙星为喹诺酮类广谱抗菌 药物，其为氧氟沙星左旋体，抗菌活性约为氧氟沙星 的 2 倍，抗 菌谱 广、抗 菌作 用强 ，但对 厌氧 菌抗 菌作 用较差。2015 年版《中国药典( 四部) 》通则 1101 无菌检 查法136 － 140 规定，药品进行无菌检查前，应首先进行方 法适用性试验，以确定其适宜性，避免造成微生物漏检。 因为大部分药品对微生物有一定的抑菌性，特别是抑菌 性很强的抗菌类药品，受微生物污染后，微生物受其抑 菌性的影响不能正常繁殖，细胞受损伤但并未死亡，服用该药品后，药品在患者体内的抑菌性逐渐减弱，受损微 生物逐渐复苏并进行正常繁殖，从而对患者造成危害。 常规方法无法检出药品污染微生物情况，只能通过稀释 液或培养基稀释、薄膜过滤、加中和剂或灭活剂等方法 消除药品的抑菌性后才可充分检出污染微生物。

仪器: HTY － 601 型集菌仪( 杭州泰林生物技术设备 有限公司) ; SHINVLMQC 型压力蒸汽灭菌器( 山东新华医 疗器械股份有限公司) ; WGP － 600 型恒水式电热恒温培 养箱( 重庆万达实验仪器厂) ; LRH-250型生化培养箱( 上 海一恒科学仪器有限公司) ; HFsafe － 760S 型生物安全柜 ( 上海力申科学仪器有限公司) ; PB － 10 pH 酸度计( 德国 Sartorius 公司) ; 涡旋振荡仪( 德国 IKA 公司) ; DGB220 型 薄膜过滤器( 杭州泰林生物技术设备有限公司) 。 试药: 注射用甲磺酸左氧氟沙星注射剂[陕西博森 生物制药股份集团有限公司，批号为 20170428 － 5，规 格为 0． 3 g( 以左氧氟沙星计) ]。 培养基与冲洗液: 硫乙醇酸盐流体培养基( FTM，批 号为 20180418) ，胰酪大豆胨液体培养基( TSB，批号为 20180630) ，沙 氏 葡 萄 糖 液 体 培 养 基 ( SDB，批 号 为 180916) ，沙 氏 葡 萄 糖 琼 脂 培 养 基 ( SDA，批 号 为 170316) ，0． 1% 蛋白胨水溶液( 批号为 20170602) ，均购 于北京陆桥技术有限责任公司。

将金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌分 别接种于胰酪大豆胨液体培养基中，生孢梭菌接种于硫 乙醇酸盐液体培养基中，35 ℃ 条件下培养 24 h; 将白色 念珠菌接种于沙氏葡萄糖液体培养基中，25 ℃ 条件下 培养 3 d。上述培养物用无菌 0． 9% 氯化钠溶液制成适宜 浓度的菌悬液; 将黑曲霉接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基 上，25 ℃ 条件下培养 7 d，加入 5 mL 含 0． 05% ( V / V) 聚山梨酯 80 的无菌 0． 9% 氯化钠溶液，洗脱孢子，收集 孢子悬液，用相同无菌 0． 9% 氯化钠溶液制成适宜浓 度的孢子悬液。菌液稀释度及接种量见表 1。

1． 2． 2 无菌方法适用性研究

试验Ⅰ组: 开启集菌仪，取供试品 20 支，每支以 0． 1% 蛋白胨水溶液约 10 mL 溶解，取半量导入薄膜过 滤器内，用 0． 1%蛋白胨水溶液冲洗滤膜 3 次，每次 100mL， 最后 1 次冲洗过程在滤膜内留少量溶液，再分别加菌落 数小于 100 cfu 的 6 种试验菌，过滤。每个培养管内灌注100 mL 培养基，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽 孢杆菌和生孢梭菌采用硫乙醇酸盐流体培养基，白色念 珠菌和黑曲霉采用胰酪大豆胨液体培养基。硫乙醇酸盐 流体培养基 35 ℃ 条件下培养，胰酪大豆胨液体培养基 25 ℃条件下培养，均培养 5 d。

可见，当采用 0． 1% 蛋白胨水溶液冲洗 滤膜 300 mL 时( 试验Ⅰ组) ，6 种试验菌均未变浑浊; 冲洗量增至 600 mL 并在冲洗液中添加终体积分数为 5% 聚山梨酯 80 时( 试验Ⅳ组) ，白色念珠菌和黑曲霉变 浑浊，其余 4 种细菌始终澄清; 当采用 0． 1% 蛋白胨 水 溶液冲洗滤膜 300 mL 并在最后 1 次冲洗过程添加 2 mL 浓度为 1 mol / L 的 MgSO4 时( 试验Ⅱ组) ，金黄色 葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌和黑曲 霉均变浑浊，而大肠埃希菌始终澄清; 即使将 1 mol / L 的 MgSO4 加入量增至 4 mL 时( 试验Ⅲ组) ，或冲洗次数增至 6 次时(Ⅴ组)，也未去除甲磺酸左氧氟沙星对大肠 埃希菌的抑菌性; 当采用 0． 1% 蛋白胨水溶液 600 mL 冲洗滤膜并添加 4 mL 浓度为 1 mol / L 的 MgSO4 时( 试 验Ⅵ组) ，大肠埃希菌变浑浊。因此，可取规定量供试品， 每支同步以 0． 1% 蛋白胨水溶液约 10 mL 溶解，导入集 菌过滤器内，采用薄膜过滤法，用 0． 1% 蛋白胨水溶液 600 mL 冲洗滤膜，最后 1 次冲洗过程在滤膜内留少量 溶液，加入 1 mol / L MgSO4 溶液 4 mL，作用 20 min，最后 在培养管内加入 100 mL 适宜培养基进行无菌检查，并 以大肠埃希菌为阳性对照菌。

无菌检查是有关药品安全性的一种定性试验。 无菌检查法是针对无菌工艺产品和最终灭菌产品的无 菌性而建立的检验法，药典要求，无菌药品包括各类注 射用制剂、眼科用制剂及用于手术、严重烧伤、严重创伤 等的产品。即进入人体血液循环系统、植入或埋入肌肉、 皮下组织、与创伤部位接触的产品、材料、器械及医学使 用上要求无菌的品种，均可按本方法进行无菌检查。 注射用甲磺酸左氧氟沙星直接进入人体血液循环，故应 对其进行无菌检查，以确保用药安全。



 

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