恒温培育箱对针刺对干眼的抗炎作用的分析

与空 白组相比，模型组、假针刺组、拮抗组、拮抗加针刺组 干眼模型兔泪腺中 α7nAChＲ 含量和 ACh 含量均显 著降低，差异均有统计学意义( 均为 P ＜ 0． 05) 。与 模型组相比，空白组、西药组、针刺组干眼模型兔泪 腺中 α7nAChＲ 含量和 ACh 含量均显著升高，差异均 有统计学意义( 均为 P ＜ 0． 05) 。干眼是临床常见的眼表疾病，以眼部干涩感、 异物感、畏光、眼红、刺痛，视力波动、视疲劳，甚至 强烈的不适感等为主要临床表现，严重影响人们的 工作与生活。其发病率逐年上升，流行病学调查显示，干眼发病率为 6% ～ 30% 。

华佗牌一次性无菌针灸针( 苏州医疗器械厂生产，产品批号: 140314) ; Schirmer 试 纸 ( 天津晶明新技术开发有限公司，批 号: 20140505) ，兔 α7nAChＲ、Ach ELISA 试剂盒( 南京金 益柏 生 物 技 术 有 限公司) ，α-BGT ( Sigma，批 号: 047K4034，规格 5 mg) ，多功能酶标仪( 美国 Biotek 公司，型号: ELX800) ，恒温培育箱( 上海一恒科学仪器有限公司，型号: GHP-9050N) ，荧光 PCＲ 仪( 美国 Life 公司，型号: Quantsdudio7) ，氢溴酸东莨菪碱( 成都普菲德生物技术有限公司) ，氟米龙滴眼液( 参天制药有限公司，批号: 1FM4362) 。

引物序列依据 Gen-Bank 公 布的序列进行设计，引物设计由上海生工生物工程 有限公 司 负 责 完 成，本实验所用引物序列如下:JAK2: 正 向: 5’-CATCAGTGGTGGCTTCATCC-3’，反 向: 5 ’-TGTCAATCTGGCGATTCTGG-3 ’; STAT3: 正 向: 5 ’-AAGAGCCAAGGAGACATGCAG-3 ’，反 向: AATGCTTCTCCGCATCTGGT; 兔 GAPDH: 正 向: 5’- GGCACGGTCAAGGCTGAGAAC-3’，反 向: 5 ’-GGTGAAGACGCCAGTGGATTCC-3’。

选取 42 只健康新西兰兔 ( 南京青龙山动物养殖场，许可证号: SCXK-苏 2012- 0008) ，雌雄不拘，体质量 1． 5 ～ 2． 0 kg，裂隙灯和眼 底镜检查眼前节及眼底无异常，Schirmer 实验 ＞ 10 mm /5 min 的动物入组。所有动物饲养于 12 h 光照/ 12 h 黑暗的环境中，自由摄食和饮水。依据随机数 字表法将动物分为 7 组，空白组、模型组、西药组、针 刺组、假针刺组、拮抗组、拮抗加针刺组，每组 6 只。 动物实验经南京中医药大学伦理委员会审查通过， 所有操作均按照实验动物保护条例进行。 空白组不做处理，其余各组动物每天 8 ∶00、 11∶00、14∶00 和 18∶00 时皮下注射氢溴酸东莨菪 碱，每次 2． 0 mg( 配制成氢溴酸东莨菪碱溶液每 次 1 mL) ，连续21 d，各组动物 Schirmer 实验均值≤5 mm /5 min 且角膜染色阳性为制作干眼炎症模型成 功。造模成功后，模型组继续给予氢溴酸东莨菪碱 注射，直至实验结束。西药组造模成功后开始于每 天 8∶00、13∶00、18∶00 时给予氟米龙滴眼液，双 眼滴眼治疗，连续治疗 14 d。针刺组于造模成功后 开始给予针刺治疗，穴位: 睛明、攒竹、丝竹空、太阳 穴、瞳 子 髎。睛明穴针尖向内下方斜刺入皮 下 3 mm，攒竹穴向下平刺 3 mm，太阳穴直刺 3 mm，瞳子 髎向外平刺 3 mm，均不行针，留针 15 min。丝竹空 透太阳穴，每侧电针正极接丝竹空穴，无关电极接翳 风穴。选用 WQ1002 韩氏电针治疗仪，采用疏密波， 频率 4 Hz/20 Hz，脉冲宽度 0． 5 ms，强度 1 mA( 强度 以针刺部位肌肉出现轻微抽动为准) ，留针 15 min， 每天 1 次，同时皮下注射氢溴酸东莨菪碱( 同模型 组) ，连续 14 d。假针刺组于模型建立成功后，每天在与针刺组相同时间用钝头针点刺相同穴位治疗， 不刺入以避免得气，同时皮下注射氢溴酸东莨菪碱 ( 同模型组) ，连续 14 d。拮抗组从皮下注射氢溴 酸东莨菪碱 21 d 后( 即第 22 天干眼实验动物模型 制作成功) 开始，经兔耳缘静脉注射 α-BGT，剂量 4． 0 μg·kg － 1，同时皮下注射氢溴酸东莨菪碱 ( 同模型组) ，连续 14 d。拮抗加针刺组于造模成 功后，经实验兔耳缘静脉注射 α-BGT，按 4． 0 μg· kg － 1 剂量给药，同时开始进行针刺治疗，针刺方法 同上，同时皮下注射氢溴酸东莨菪碱( 同模型组) ， 连续 14 d。

实验前，实验第 21 天和第 35 天 采用 Schirmer 实验方法分别检测各组实验兔泪液分 泌量; 实验第 35 天用 ELISA 法检测泪腺中 ACh 及 α7nAChＲ 含量，PCＲ 法检测泪腺中 JAK2 /STAT3 基 因表达水平。 1． 2． 3 Schimer 实验方法 泪液检测滤纸条一端折 叠放入下睑 1 /3 结膜囊内，5 min 后取出滤纸，从折 叠处测量其湿润长度。

将兔处死后即刻取出泪 腺，用生理盐水冲洗后称质量，在冰浴中充分匀浆， 加 300 μL 生理盐水稀释，离心后取上清液，用 ACh 试剂盒检测，用酶标仪测定 ACh 及 α7nAChＲ 含量。 泪腺中 ACh 及 α7nAChＲ 含量均采用 ABC-ELISA 法 检测，试剂盒由南京金益柏生物科技有限公司提供， 实验步骤按试剂盒操作说明进行。

取少量组织液氮速冻并存 于 1． 5 mL Eppendorf 管中，加入 1 mL Trizol 试剂，提 取总 ＲNA，参照逆转录试剂盒操作逆转录为 cDNA， 设置反应条件 37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，参照说明书进 行实时荧光定量 PCＲ 反应，扩增条件 95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，循环 40 次，同时做熔解曲线，重复 3 次，Quantsdudio7 型荧光 PCＲ 仪输出实验结果，结 果采用相对定量法计算 2 － ΔΔCt ，统计 ＲQ 值。

采用 SPSS 19． 0 统计软件进行统 计分析，计量资料采用 x珋± s 表示，组间比较采用单因 素方差分析，多重比较采用 LSD 和 Dunett 法，以 P ＜ 0． 05 为差异有统计学意义。

泪液分泌量检测结果 显示: 实验第 21 天、第 35 天，模型组、假针刺组和拮 抗组与实验前相比，泪液分泌量均显著下降( 均为 P ＜ 0． 05) ; 实验第 21 天西药组、针刺组和拮抗加针 刺组与实验前相比，泪液分泌量均显著下降( 均为 P ＜ 0. 05) ，而实验第 35 天 3 组与实验前相比，差异 均无统计学意义( 均为 P ＞ 0． 05) 。实验第 21 天、第 35 天，空白组与模型组相比，泪液分泌量升高，差异 均有统计学意义( 均为 P ＜ 0． 05) ; 实验第 35 天，西 药组、针刺组、拮抗加针刺组与模型组相比，泪液分泌量亦升高，差异均有统计学意义( 均为 P ＜ 0． 05) 。 实验第 21 天，模型组、西药组、针刺组、假针刺组、拮 抗组、拮抗加针刺组与空白组相比，泪液分泌量下 降，差异均有统计学意义( 均为 P ＜ 0． 05) ; 实验第 35 天，模型组、假针刺组、拮抗组、拮抗加针刺组与空白 组相比，泪液分泌量亦下降，差异均有统计学意义 ( 均为 P ＜ 0． 05) 。Schirmer I 实验结果说明氢溴酸 东莨菪碱造模 21 d 有效，西药和针刺治疗可增加干 眼模型兔的泪液分泌量。与空白组相比，西 药 组、针刺组兔泪腺中 JAK2 mＲNA 相对表达量显著升高，差异均有统计学意义 ( 均为 P ＜ 0． 05) ; 拮抗组、拮抗加针刺组兔泪腺中 JAK2 mＲNA 相对表达量显著降低，差异均有统计学 意义( 均为 P ＜ 0． 05) 。与模型组相比，西药组、针刺 组兔泪腺中 STAT3 mＲNA 和 JAK2 mＲNA 相对表达 量均 显 著 升 高，差异均有统计学意义 ( 均 为 P ＜ 0. 05) ; 拮抗加针刺组兔泪腺中 JAK2 mＲNA 相对表 达量显著降低，差异均有统计学意义( P ＜ 0． 05) 。

α7nAChＲ 介导的 JAK2 /STAT3 信号转导通路为 基础的抗炎途径，在调控炎症的发生发展中起重要 作 用。因 此，本 研 究 中，我们通过分析针刺对 α7nAChＲ 受体介导的 JAK2 /STAT3 信号转导通路的 影响，试图探讨针刺治疗干眼的疗效机制。通过检 测针刺前后泪液分泌量，泪腺中 α7nAChＲ 和 ACh 含 量，以及通路相关因子 STAT3、JAK2 mＲNA 表达情 况，进一步明确针刺可以调控 α7nAChＲ 及其介导的 JAK2 /STAT3 信号通路从而治疗干眼。本研究结果 显示: 针刺治疗能够激活干眼模型兔 JAK2 /STAT3 信号通路，升高泪腺内 JAK2、STAT3 mＲNA 相对表 达量，而应用 α7nAChＲ 特异性拮抗剂银环蛇毒阻断 后，其表达量降低。从这一点来讲，针刺能够调控 α7nAChＲ 及其介导的 JAK2 /STAT3 信号转导通路， 发挥一定的抗炎效果。