人工气候箱在烟草的差异代谢物分析的使用

目前，我国烟草种质的遗传多样性水平较低、 遗传基础相对狭窄，限制了烟叶品质的进一步提 高。通过远缘杂交引进外源基因以改良品种、形成 新物种和新类型已成为烟草育种的发展趋势。烟 叶燃烧后释放的烟气富含 4 800 余种化学成分，有 1/3 直接来源于烟草本身，其余的是通过燃烧、裂 解、蒸馏、冷凝等一系列复杂的物理化学过程新产 生的，因此，烟草内源性物质的含量及性质直接影 响了卷烟制品的安全性与可用性。

供试烟草远缘杂交新品种曼陀罗烟及其亲本 烤烟品种 78- 04，由山西农业大学烟草育种研究室 提供。MS 固体培养基（北京索来宝），NMR 试剂重 水（美国 Norell）；氘代甲醇、氘代氯仿（德国 Merck） 等。Bruker 600- MHz Avance Ⅲ NMR Spectrometer （德国布鲁克公司），KDC- 140HR 型高速冷冻离心 机 （安徽中科中佳），MGC- 350HP 智能型人工气候 箱（上海一恒）等。

试验于 2018 年 3—8 月在山西大学进行。 1.2.1 烟草幼苗的培养 挑选颗粒饱满的种子，于 培养皿中先用无菌水浸泡 24 h，再用 75%乙醇浸泡 1 min，10% H2O2 浸泡 15 min，无菌水冲洗干净后接 种于 MS 培养基上，暗培养至种子破皮后，人工气 候箱内进行光照培养（温度 26 ℃，湿度 75%）。 1.2.2 1 H- NMR 的检测方法 参考文献的方法， 烟草幼苗培养 60 d 后，取新鲜的叶片组织，液氮研 磨。真空冷冻干燥后，称取 200 mg，置于 10 mL 的玻 璃离心管中。加入蒸馏水和甲醇各 1.5 mL、氯仿 3 mL， 室温下漩涡混匀 1 min。将混匀后的样品置于超声 清洗仪中，超声提取 25 min；室温下，3 500 r/min 离 心 25 min。取上清液，减压浓缩蒸干，对上层甲醇水 相浓缩蒸干物进行溶解处理：加入氘代甲醇 400 μL 与缓冲液 400 μL 溶解，然后使用移液枪将圆底烧 瓶中的溶液转移至离心管，4 ℃，13 000 r/min 离心10 min。取上清液 600 μL 于 5 mm 核磁管内进行 600- MHz NMR 检测，参数为 25 ℃，测定频率为 600.13 MHz，扫描次数为 64，谱宽为 12 345.679 Hz。

将核磁图导入 MestReNova 软件，对核磁图进 行定标（TSP：δ0.00），相位校准和基线校准后进行 积分处理，以 δ0.01 对积分区间进行分段积分，积分 区段为 δ0.76～9.34，切除其中甲醇峰 δ3.29～3.32。 将处理后的数据保存。使用 SIMCA- P 13.0 软件对 上述处理的积分数据作 PCA 和 OPLS- DA 分析，找 出样品中的差异性代谢物。

对分离得到的提取物的核磁图谱进行代谢物 指认，根据文献提供的化合物化学位移、耦合 常数以及核磁数据库，从烟叶甲醇水相的图谱中共 指认出 18 个代谢物，主要包括氨基酸类（亮氨酸、 缬氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、γ- 氨 基丁酸、天冬氨酸、色氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、甘氨 酸）、糖类（β- 葡萄糖、α- 葡萄糖、蔗糖）、有机酸类 （延胡索酸、甲酸）、胆碱等物质。然后采用多元统计 分析对数据进一步挖掘：在 PCA 得分散点图的基础 上建立 OPLS- DA得分图，以消除组内及随机误差，使 得数据的整体特征和变化规律更加明显，提高模型 的有效性和解析力。筛选组间的差异性代谢物（图 1）：由得到的 OPLS- DA 得分图和 S- PLOT 图，同时 结合 S- PLOT 图中 VIP 值（＞1）寻找不同基因型烟 草中的差异性代谢物，可见曼陀罗烟与 78- 04 能明 显区分，其化学成分差异主要涉及 γ- 氨基丁酸、β葡萄糖、α- 葡萄糖、脯氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、异 亮氨酸、甘氨酸等代谢物，尤以氨基酸类最为明显。

3 讨论

在植物代谢组学研究中，核磁共振波谱技术（NMR）和色谱 - 质谱联用技术（GC/MS 或 LC/MS） 是目前最常用的技术平台，主要被应用于揭示植物 对环境扰动代谢调控的生物标记物以及植物对遗传改变的代谢应答、鉴别不同基因型材料的差异。 基于 GC/MS 的分析显示，苹果酸和柠檬酸是辨别 不同基因型拟南芥 （Arabidopsis thaliana）（Col0 和 C24）最重要的代谢物，葡萄糖和果糖是辨别其杂交 一代 F1 （C24×Col0 和 Col0×C24）最重要的代谢 物。基于 1 H- NMR 的代谢轮廓分析发现，色氨酸、甲 酸、脯氨酸和苏氨酸的含量差异与 2 个基因型（褐 色籽与黄色籽）埃塞俄比亚芥（Brassica carinata）的 耐盐性差异密切相关，为生物乙醇材料的筛选提供 了依据。基于 1 H- NMR 的代谢指纹分析，确定了区 分野生型与表达水杨酸生物合成基因萨姆逊烟草 植株的主要成分是绿原酸、苹果酸、葡萄糖和蔗糖； 野生与栽培胡萝卜（Daucus carota L.）幼苗的绿原 酸、阿魏酰奎尼酸含量存在差异，并表明其杂种后 代具有母本遗传或野生品质优势。但这 2 种方法 各具优点和局限性，要对所有代谢产物进行无偏向 性的完整分析，1 H- NMR 与 GC/MS 相结合将是比较 理想的手段。