一恒对鸡肝脏组织程序性坏死研究

硒( selenium) 是一种调节与维持机体内环境稳 态的必需重要微量元素，参与构成动物体内抗氧化 剂，影响细胞免疫、体液免疫及非特异性免疫，因此对 维持机体健康具有重要意义。不同化学形式的硒 在吸收和代谢上有很大差异: 无机硒在小肠中被动吸 收，转化成硒化物后与血浆蛋白结合，运送到肝脏或 合成硒蛋白; 有机硒则被小肠主动吸收后运送到肝 脏，与硒蛋白或机体组织蛋白结合。与无机硒比较， 有机硒毒性小、生物利用率高。已有试验证明，生 物源性纳米硒可以诱导活性氧( ＲOS) 介导的癌细胞程序性坏死，从而诱发癌细胞死亡，达到抑癌效果。 富硒乳酸菌可减轻 CCl4 诱发的肝损伤过程，吲哚 硒( IND Se ) 可减轻免疫性肝损伤小鼠的病理变化。硒缺乏会导致心脏病、癌症和糖尿病等多种 疾病，鸡缺硒可导致免疫器官发生坏死。Yang T． S． 等研究发现，敲低鸡 miＲ－200a－5p 的表达能够颉 颃缺硒诱导的鸡心脏程序性坏死。

1 材料

1. 1 试验动物

5 月龄健康伊莎褐蛋鸡 200 只，体重约为 1. 6 kg， 购自哈尔滨市先锋孵化厂。

1. 2 主要试剂

蛋氨酸硒，购自江苏采薇生物科技有限公司; 超 氧化物歧化酶( SOD) 测定试剂盒、丙二醛( MDA) 测 定试剂盒、过氧化氢酶( CAT) 测定试剂盒、谷胱甘肽 过氧化物酶( GSH－Px) 测定试剂盒、谷胱甘肽( GSH) 测定试剂盒等，均购自南京建成生物工程研究所; TＲIzol 试剂，购自 TaKaＲa 公司; 固相 ＲNase 清除剂， 购自北京天恩泽生物技术有限公司; 氯仿、异丙醇等， 购自天津博迪化工股份有限公司; DEPC，购自 Sigma 公司; 实时荧光定量 PCＲ 引物，均购自上海生工生物 工程技术服务有限公司; SYBＲ GreenⅠ荧光染料，购 自杭州博日科技有限公司; cDNA 反转录试剂盒，购 自北京全式金生物技术有限公司。

1. 3 主要仪器

紫外分光光度计，购自通用电气医疗集团生命科 学部; 电热恒温水槽，上海一恒科技有限公司生产; －80 ℃超低温冰箱，购自美国 Thermo 公司; 分析天 平，由上海精密科学仪器有限公司提供; 高速低温离 心机，购自 Sigma 公司; 冷藏冰箱，青岛海尔公司生 产; Ｒealtime ＲCＲ 仪，购自杭州博日科技有限公司; 超 净工作 台，购自哈尔滨市东联电子技术开发有限 公司。

2 方法

将 200 只 5 月龄健康伊莎褐蛋鸡随机分为对照 组和富硒组，每组 100 只。对照组正常饲养，饲料中 硒含量为 0. 2 mg / kg; 富硒组饲喂添加蛋氨酸硒的饲料，硒含量为 0. 5 mg / kg。试验周期为 60 d，试验结 束时，将每组鸡再随机分为 2 组，即对照组+生理盐 水( C 组) 、对照组+LPS( LPS 组) 、富硒组+生理盐水 ( Se 组) 、富硒组+LPS( Se+LPS 组) ，每组 50 只。LPS 剂量为按体重 0. 2 mg / kg，以腹腔注射方式建立 LPS 诱导的肝脏损伤动物模型，对照组注射等量生理盐 水。注射 24 h 后剖杀，采集肝脏样本，根据检测需要 进行处理和保存。将固定在甲醛中用于光镜检查的肝脏组织块按 照常规方法制成病理石蜡切片，H．E．染色，用光镜观 察显微结构，拍照并记录。 按照常规方法将肝脏组织块制成环氧树脂切片， 用透射电镜观察超微结构，拍照并记录。采用 SYBＲ GreenⅠ荧 光染料法，扩增体系的总体积为 10 μL。扩增体系: cDNA 模板 1 μL，SYBＲ GreenⅠ荧光染料 5 μL，灭菌 水 3. 4 μL，待测基因的上游引 物和下游引物各 0. 3 μL。扩增程序: 95 ℃ 预变性 5 s; 60 ℃ 退火与延 伸 34 s，共 40 个循环，最后进行熔解反应。所有样品 做 3 个重复孔。

3 结果与分析

Se 组细胞结构清晰，线粒体结构清晰，线粒体 嵴无肿胀变形LPS 组核膜皱缩破裂，形状不规则，双层膜结构不完整，核内染色质 浓缩，线粒体肿胀，线粒体嵴断裂，细胞质中有大量空 泡状线粒体以上结果表明蛋氨酸硒能有效 颉颃 LPS 诱导的程序性坏死。C 组与 Se 组比较，NF－κB、TNF－α、 MyD88 mＲNA 的相对表达量差异不显著( P＞ 0. 05) ， LPS 组和 Se+LPS 组 NF－κB、TNF－α、MyD88 mＲNA 相对表达量均显著高于 C 组和 Se 组( P＜0. 05) ，Se+ LPS 组 NF－κB、TNF－α、MyD88 mＲNA 相对表达量显 著低于 LPS 组( P＜ 0. 05) 。以上结果说明蛋氨酸硒 能降低 LPS 诱导的炎症因子表达。，C 组与 Se 组比较，IL－1β 和 IL－18 mＲNA 相对表达量差异不显著( P＞ 0. 05) ，LPS 组和 Se+LPS 组 IL－1β 和 IL－18 mＲNA 相对表达量均显著 高于 C 组和 Se 组( P ＜ 0. 05) ，Se +LPS 组 IL － 1β 和 IL－18 mＲNA 相对表达量显著低于 LPS 组 ( P ＜ 0. 05) 。以上结果说明蛋氨酸硒能降低 LPS 诱导的 细胞因子表达。

4 讨论

硒作为硒蛋白的主要成分，具有抗氧化、维持正 常免疫和繁殖等生物学功能，对畜禽的生长发育起促进作用，而蛋氨酸硒作为一种有机硒，与无机硒相 比具有更多优点和更高的利用价值。程序性坏死是 一个高度可调控的过程，在多种急慢性炎症疾病的生 理病理及临床治疗中有重要意义，当细胞自身的凋亡 通路受到抑制时，程序性坏死可以导致细胞的死亡， 因此程序性坏死是细胞无法正常启动凋亡通路时诱 导细胞死亡的重要方式。申兵冰等研究发现， LPS 能诱导动物组织和细胞发生程序性坏死。已有 研究证实，ＲIP1、ＲIP3 和 MLKL 是执行程序性坏死的 关键蛋白和调控信号通路的重要因子，参与介导程序 性坏死的发生。目前的研究认为，细胞程序性坏死途 径经 TNF－α /TNFＲ1 /ＲIP1 所形成的复合体Ⅰ启动，经 ＲIP1 和 ＲIP3 的复合体Ⅱb 进一步向下游传递， MLKL 作为 ＲIP3 下游的特异性底物执行程序性坏死 的发生。本试验通过实时荧光定量 PCＲ 检测发 现，在 LPS 刺激动物模型中 ＲIP1、ＲIP3、MLKL 的表 达情况均显著上调，说明 LPS 动物模型成功诱导出 肝脏程序性坏死。