人肝癌细胞SMCC-7721自噬流的影响分析！！！

据统计，原发性肝癌发病率在恶性肿瘤中居第 6 位，死亡率居第 4 位，我国肝癌患者死亡人数占全球 一半以上。中医药资源丰富，是治疗原发性肝癌的 手段之一，长期服用毒副作用低。有研究表明，中 药在抑制血管新生、抗凋亡、调节免疫及改善生活质 量等方面发挥了重要的作用。益气化瘀解毒方是 全国名中医潘敏求教授治疗肝癌效验方。我们前期研 究发现，其可下调人肝癌细胞 CXCL12/CXCR4/ CXCR7 趋化因子轴，抑制细胞增殖及迁移，同时能 降低肝癌裸鼠移植瘤血管密度（MVD），抑制低氧诱 导因子-1α（HIF-1α）、血管内皮生长因子（VEGF） 的表达，从而发挥抗肿瘤作用。下调 HIF-1α 能通 过多种途径促进 VEGF 的表达，VEGF 是 PI3K/mTOR 信号通路上游的关键靶点之一，且 PI3K/mTOR 信号 通路是参与细胞自噬的经典途径之一。因此，在前期 实验的基础上，本研究以 PI3K/mTOR 信号通路介导 肝癌细胞自噬性死亡为可能机制，进一步探讨益气化 瘀解毒方抗肿瘤的作用途径，为开发抗肝癌多靶点的 中药新药提供依据。

1 实验材料

1.1 细胞

人肝癌细胞 SMCC-7721，武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 药物

益气化瘀解毒方（黄芪 30 g，白参 10 g，半枝莲 30 g，醋莪术 15 g，甘草 5 g），饮片均购自湖南中医 药大学附属第一医院中药房；索拉非尼，南通飞宇生 物科技有限公司，批号 FY34720409，20 mg/支，含 量≥98%；重楼皂苷Ⅰ，南通飞宇生物科技有限公司， 批号 FY11010222，50 mg/支，含量≥98%；雷帕霉素， 南通飞宇生物科技有限公司，批号 FY3415RKR089， 20 mg/支，含量≥98%。

1.3 主要试剂与仪器

双抗（青霉素-链霉素）、胎牛血清、PBS、DMEM 和胰蛋白酶，Gibco 公司；细胞冻存液，天津灏洋； mGFP-RFP-LC3（LC3 自噬双标腺病毒），汉恒生物； 一抗，Abcam 公司；BSA，华美公司；PVDF 膜， Amersham 公司，HRP 偶联山羊抗鼠、兔 IgG，Sigma 公司。0.22 mm 移液枪（Gilson），细菌滤器（Millipore），无菌盒装吸头（Axygen），一次性离心管（Corning）， 细胞培养皿（ Nest biotechology ），细胞培养板 （Costar），巴氏吸管（武汉博士德），氨基载玻片（天 津灏洋），爬片（SORFA），培养瓶（Corning），超净 工作台（SW-CJ-1FD，苏州苏洁净化设备有限公司）， 离心机（TD5A，长沙英泰仪器有限公司），倒置显微 镜（XDS-1B，重庆光电北京有限公司），恒温水浴锅 （上海一恒科学仪器有限公司），水浴箱（上海一恒科学仪器有限公司），共聚焦显微镜（FV1000，日本 Olympus）。

2 实验方法

2.1 细胞培养

将人肝癌细胞 SMCC-7721 接种于高糖培养液中 （含 10%胎牛血清），置于 90%N2-5%CO2-5%O2 培养 箱培养。

2.2 药物制备

将益气化瘀解毒方饮片煎煮并浓缩至每 1 mL 含 1 g 原药材，滤纸粗滤，将药物按一定比例配制成含 中药的 DMEM 溶液。使用前将药液分别稀释至 5 g/L。 重楼皂苷Ⅰ：将 50 mg 样品溶于 0.25 mL DMSO 中 配制成母液，并将母液溶于 DMEM，配制成 50 mg/L。 索拉非尼：将 200 mg 样品溶于 DMSO，再将溶有索 拉非尼的 DMSO 溶于 DMEM，配制成 6 μmol/L 溶 液。雷帕霉素：将 20 mg 雷帕霉素溶于 DMSO，再将 溶有雷帕霉素的DMSO溶于DMEM，配制成4 μmol/L 溶液。

2.3 分组和给药

实验分为益气化瘀解毒方组、重楼皂苷Ⅰ组、雷 帕霉素组、索拉非尼组和空白对照组。每孔加入已配 制好的药液 2 mL，干预 24 h。 2.4 免疫荧光检测 取贴壁对数生长期的细胞，加入配制好的腺病毒 （1 μL 腺病毒∶1 mL DMEM）1 mL，置于培养箱中 培养 6 h 后加入药物干预，24 h 后，加入预冷多聚甲 醛 2 mL，室温静置 10 min；用吸水纸吸干，滴入荧 光淬灭剂封片，在荧光共聚焦显微镜下观察。

3 统计学方法

采用 SPSS21.0 统计软件进行分析。计量资料以x±s 表示，多组均数间比较采用方差分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

4 讨论

全国名老中医潘敏求教授结合其多年临床经验， 将肝癌病因病机总结归纳为“虚”“毒”“瘀”：肝癌 患者常见脘腹胀满、神疲乏力、消瘦、纳呆、大便溏 结等为“脾虚”之症；肝癌病情复杂、发展变化快、 预后差，常合并肝炎、肝硬化等病史，同时多种病理因素夹杂，这些均属中医学“毒”或“癌毒”范畴； 肝癌常见的上腹肿块及肝区固定疼痛等，是“瘀”的 客观表现。癌乃“因虚致癌”，先有正气不足，而后 受外来“邪毒”侵袭，导致毒瘀互结而成，癌变进一 步发展使正气更虚，从而又表现出“因癌致虚”的现 象，血瘀、邪毒、正气虚三者始终并存，互为因果， 恶性循环，贯穿于肝癌整个病程。潘老在此基础上提 出，“健脾理气、化瘀软坚、清热解毒”为肝癌基本 治法，并拟定益气化瘀解毒方为治疗肝癌基础方。方 中重用黄芪、白参，取其健脾益气、扶正固表之功， 并以醋莪术化瘀止痛，半枝莲清热解毒，甘草调和诸 药，全方共奏益气化瘀、清热解毒之效。