一恒分享补肾中药对老化间充质干细胞的影响

老化可使机体整体内环境发生巨大改变，也使骨髓内 微环境与复杂的细胞内、外信号调控发生改变。衰老大鼠 的氧化应激可能是导致年龄相关性骨丢失的重要致病机 制，老化使间充质干细胞更趋向于分化为脂肪细胞，而 不是成骨细胞，骨量持续性减少和丢失，导致骨质疏松症 发生。既往研究表明，补肾中药能诱导间充质干细 胞成骨分化、提高抗氧化能力抑制成脂分化，但它能否通 过改变细胞内外微环境起到同样的作用尚不明确，故本实 验为此进行了研究。

1 材料

金匮肾气丸、健骨二仙丸、六味地黄丸来源于广东省 中医院药学部 ( 金匮肾气丸由干地黄、山药、山萸肉、泽 泻、茯苓、牡丹皮、桂枝、附子按 8 ∶ 4 ∶ 4 ∶ 4 ∶ 3 ∶ 3 ∶ 1 ∶ 1 比例组成，健骨二仙丸由龟板、鹿角胶、党参、枸杞子、 续断、山药按 1 ∶ 1 ∶ 3 ∶ 6 ∶ 6 ∶ 6 比例组成; 六味地黄丸由 熟地黄、山药、山萸肉、泽泻、茯苓、牡丹皮按 8 ∶ 4 ∶ 4 ∶ 4 ∶ 3 ∶ 3 比例组成) 。清洁级健康 SD 成年大鼠 40 只， 体质量 ( 200±50) g，63～ 70 d，雌雄各半，购自广东省医 学实验动物中心，动物生产许可证号 SCXK ( 粤) 2013-0002。胎牛血清 ( 货号 SH30087. 01) 、DMEM-F12 培养基 ( 货 号 SH30023. 01B ) 、 DMEM-高 糖 培 养 基 ( 货 号 SH30022. 01B) 、青链霉素 ( 货号 SH30010) 、磷酸钾缓冲 液 ( 货号 SH30256. 01B) ( 美国 Hyclone 公司) ; cellTiter 96 AQ 单溶液细胞增殖检测试剂 ( 货号 G3582，美国 Promega 公司) ; 成骨诱导培养基、成脂诱导培养基 ( StemPro  Adipogenesis Differentiation Kit，美 国 Gibco 公 司，货 号 A10070-01) 。洁净工作台 ( 苏州安泰空气技术有限公司， 型号 SW-CJ-IFD) ; 低速离心机 ( 安徽中科中佳科学仪器有 限公司，型号 SC3614) ; 倒置光学显微镜 ( 型号 CKX41、 U-CTＲ30-2，日本 Olympus 公司) ; 上海一恒LHS-100CH恒温恒湿培养箱; 倒置荧光显 微镜 ( 德国 Leica 公司，型号 DMI6000B) 。

2 方法

2. 1 含药血清制备

金匮肾气丸、健骨二仙丸、六味地黄 丸浓煎后，分别按照 89. 1、75. 9、85. 8 g /kg 剂量灌胃给 药，每天 2 次，连续 7 d，最后 1 d 灌胃给药后 2 h 再次给 药。第 2 次给药后 1 h，大鼠腹主动脉取血，离心，取上 清，除菌，灭活，分装，－80 ℃ 保存备用。根据前期实验筛选出的 10% 含药血清，将其随机分为空白组、模型 组、健骨二仙丸组、六味地黄丸组、金匮肾气丸组。

2. 2 模型建立及鉴定

10 只大鼠冲出骨髓细胞培养， 每 3 d 换液 1 次，培养 7 d，300 μmol /L H2O2 处理 24 h。 然后，通过 β-半乳糖苷酶染色鉴定，方法为固定 15 min， 洗涤，染色 12 h，显微镜下观察。

2. 3 细胞增殖检测

采用 MTS 法。收集 0、48 h 细胞，加 入 cellTiter 96 AQ 单溶液细胞增殖检测试剂 4 h 后酶标仪读 板，读取 490 nm 波长处 OD 值，计算增殖率，公式为增殖 率= ( 48 h 平均 OD 值/0 h 平均 OD 值－1) ×100% ( 同一 样品) 。

2. 4 成骨诱导、茜素红染色及 ALP 活性检测

当各组细 胞贴壁生长达到 80%融合时成骨诱导，培养 3 d 后再维持 7 d，观察细胞形态，检测 ALP 活性，具体检测步骤按试剂 盒说明书进行。继续培养至 14 d 后，茜素红染色鉴定成骨 细胞。

2. 5 成脂诱导及油红 O 染色

成脂诱导方法同 “2. 4”项 下成骨诱导。培养 7 d 后，油红 O 染色鉴定脂肪细胞。

2. 6 相关因子检测

经典 TＲIzol 提取总 ＲNA，检测浓度、 提纯、逆转录，rＲT-qPCＲ 采用一步法，按照说明书进行操 作，2－△△Ct 法分析各基因表达差异。然后，应用 Invitrogen 在线 引 物 设 计 软 件 OligoPer-fectTM Designer 设 计，采 用 BLAST 进行比对，探针序列由美国 Invitrogen 公司合成，根 据 NCBI 数据库序列设计 ( CollagenΙ ID 100199754，Ｒunx2 ID 12393，DLX5 ID 13395，OSX ID 170574，OCN ID 632， PPAＲγ2 ID 19016，C/EBPβ ID 12608，TAZ ID 66826) ，引 物序列见表 1。

3 结果

氧化后老化间充质 干细胞在 β-半乳糖苷酶染色阳性率明显增加，细胞核周围 有天蓝色颗粒，补肾中药处理后阳性率明显减少，H2O2 处 理后老化间充质干细胞增殖减少，而药物处理后增加。表 2、图 1 显示，与空白组比较，模型组扁平状、分布稀疏的 老年细胞数量明显增加; 与模型组比较，成脂诱导的细胞 均被油红 O 染为红色，各补肾中药组红染减少，而成骨诱 导后细胞均被茜素红染为棕褐色，各补肾中药组染色增加; 模型组 ALP 活性显著低于空白组 ( P＜0. 05) ，各补肾中药 组显著高于模型组 ( P＜0. 05) 。与 空白 组 比 较，模 型 组 OCN、Collagen Ⅰ、DXL5、OSX、 ＲunX2、TAZ mＲNA 表 达 显 著 下 调 ( P ＜ 0. 05) ，PPAＲγ2、 C/EBPβ mＲNA 表达显著上调 ( P＜0. 05) ; 与模型组比较， 各补肾中药组 OCN、DXL5、OSX、ＲunX2、TAZ mＲNA 表达 显著上调 ( P＜ 0. 05) ，PPAＲγ2、C/EBPβ mＲNA 表达显著 下调 ( P＜0. 05) 。

4 讨论

机体衰老时，内环境氧化应激水平增高，抗氧化能力 降低，导致骨质量下降，骨皮质变薄，骨髓脂肪组织增多， 具有多项分化潜能的间充质干细胞特性、增殖活性、端粒 酶活性、端粒长度、分化能力与方向随之改变，一方面涉 及老化所致的细胞自身内在因素改变，另一方面涉及细胞 外骨髓内微环境的改变。从细胞自身来说，Ｒunx2 为特异 性成骨细胞转录因子和成骨细胞分化的关键调节因子，而 OSX、Ｒunx2 是多条信号通路的共同下游基因，可作为其 下游基因启动成骨基因; TAZ 作为共同激活因子，可刺 激 Ｒunx2 转录而抑制 PPAＲγ2 转录，从而调节间充质干细 胞向成骨细胞分化，老化使其水平下调，干细胞更趋向与 脂肪分化; ALP 活性正向反映成骨细胞分化水平，Ⅰ型 胶原是骨细胞外基质的主要有机成分，前者表达取决于后 者产生量; OCN 在成骨晚期的表达随着细胞分化和基质矿 化而增加，常作为矿化晚期的标志物使用。在骨钙素、 骨涎蛋白、Ⅰ型胶原的调控序列上，均存在 Dlx5 的结合位 点，能促进骨基质的矿化，增强 Ｒunx2 基因 P1 启动子的活 性，促进成骨分化。PPAＲγ2 正向调节脂肪生成，是脂 肪细胞形成合成通路的中心转录调控因子。在分化 早期，C/EBPβ 被活化后表达增加，随后激活 C/EBPα，协 同 PPAＲγ2 共同调控脂肪分化。本实验表明，缺少C/EBPβ 的胚胎成纤维细胞脂肪生成能力明显减低。



 

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