生化培养箱在乳酸菌的分离与鉴定的使用

泡菜是一种传统发酵食品，可以多种蔬菜为主要 原料，经过发酵制成。因其操作简单，风味独特，品种 多样，且具有良好的口感而深受大众的喜爱。在我国， 主要以四川泡菜最为出名，其产品销量位居全国第 一。据不完全统计，2009 年四川泡菜产量就已经达到 了 120 万吨，产值 90 亿元。有研究表明，泡菜中存在 着多种乳酸菌，如植物乳杆菌、肠膜状明株杆菌和短 乳杆菌等。乳酸菌不仅是泡菜发酵中最主要的菌群， 还是其独特风味品质的良好来源。

豇豆、食盐：襄阳市襄城区鑫源超市；泡菜坛子：淄 博海沃家具专营店；石蕊牛乳培养液：湖北文理学院食品科学技术学院实验室自制；MRS 培养基 [蛋白胨、 牛肉膏、酵母膏、琼脂（均为生物试剂）、乙酸钠、柠檬酸 二胺、磷酸氢二钾、葡萄糖（均为分析纯）]、甘油，氯化 钠，磷酸，磷酸二氢钾：均为分析纯，国药集团化学试剂 有限公司；鲊广椒样品：从恩施州咸丰地区农户家中 采集了 5 份不同来源的鲊广椒样品，装入无菌样品瓶， 并使用样品箱迅速带回实验室。

LRH-150 生化培养箱：上海一恒科学仪器有限公 司；LXJ-IIB 型低速大容量多管离心机：上海安亭科学仪器厂；SA402B 味觉分析系统 （该系统包含 AAE、 CTO、CAO、COO、AEI 等 5 个测试传感器，2 个参比传 感器）：日本 Insent 公司；PEN3 电子鼻：德国 Airsense 公司；LC202ADXR高效液相色谱仪：日本岛津公司；KH100DY 超声波清洗机：昆山禾创超声仪器有限公司。

从采集到的 5 份恩施州咸丰地区鲊广椒中进行乳 酸菌的分离：首先取样品 2 g 加入到 15 mL 无菌的石 蕊牛乳培养基中，37 ℃培养 48 h，然后用生理盐水将 石蕊牛乳培养液稀释至梯度为 10-5、10-6 和 10-7，涂布 到含有 1 %碳酸钙的 MRS 培养基中，置于厌氧工作站 中 37 ℃培养 2 d。根据菌落的形态特征，挑选产生透明 圈的菌株，进行革兰氏染色与过氧化氢酶试验。将具 有透明圈、革兰氏阳性且过氧化氢酶阴性的菌作为待 定的乳酸菌在 MRS 平板上进行连续划线分离纯化，将 纯化后的菌株使用 30 %的甘油于-80 ℃超低温冰箱中 保存。

具体方法参照王丹丹等的方法。即将纯化后的 乳酸菌接入 MRS 培养基中收集菌体，进行菌株 DNA 的提取，然后以提取的 DNA 为模板应用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术，将扩增后得 到的产物连接载体和克隆进行基因组的测序，将测序 后获得的乳酸菌 166S rRNA 序列在 NCBI 的 GenBank 中进行 Blast 比对，选取同源性较高的菌作为模式菌 株，构建乳酸菌分离菌株系统发育树，确定所分立的 乳酸菌的系统分类地位。

泡菜制作的工艺流程：豇豆→清洗→沥干→装 坛→加入盐水→接种→发酵→产品检测。具体操作 为，菌种的准备：将分离并鉴定的乳酸菌使用 MRS 液 体培养基连续活化 3 代，并使用生理盐水重悬。配制 盐水：按照每升水称取 40 g 食盐的比例溶解、煮沸、冷 却晾凉；选材：豇豆无虫蛀，硬度好；装坛：称取豇豆 250 g，切成 5 cm 小段，装入坛中，再加入晾凉的盐水 635.5 mL；接种：按照 1 %添加量接入所分离的乳酸 菌；发酵：将装坛并接种了乳酸菌的坛子在 25 ℃条件 下放置 7 d。

从 5 份恩施州咸丰地区鲊广椒中一共分离出 44 株细菌。在厌氧工作站经含有碳酸钙的 MRS 培养基中 培养后，将观察到菌落的周围存在透明圈，革兰氏染 色呈阳性，且过氧化氢酶试验呈阴性的菌株初步确定 为乳酸菌，共有 20 株，将它们进行纯化与保存。部分 乳酸菌的菌落与细胞形态见图 1。

将得到的 20 株乳酸菌提取基因组 DNA，并通过 PCR 与测序，获得它们的 16S rRNA 序列后，在 Gen－ Bank 数据库进行 BLAST 比对，比对结果显示这些菌 株的序列均与植物乳酸杆菌（Lactobacillus plantarum）、 戊糖乳杆菌 （Lactobacillus pentosus） 及类植物乳杆菌 （Lactobacillus paraplantarum）的模式菌的 16S rRNA 序 列之间的相似度均达到 99 %以上。从 NCBI 数据库提 取相似度较高的模式菌的 16S rRNA 基因序列，使用 MEGA7.0构建系统发育树进行系统发育分析。2 发酵不同泡菜挥发性风味的分析 电子鼻是一个模仿生物嗅觉的系统，能够对大多 数挥发性成分的气体进行分析和检测，主要由三部分 组成：气体流量系统、传感器组和分析控制软件。其中 传感器组是由 10 个金属氧化气体传感器组成，分别为 W1C、W5S、W3C、W6S、W5C、W1S、W1W、W2S、W2W、 W3S。不同的传感器能够对不同种类的气味物质做出 响应，并且不受到主观因素的影响，因此可以用来对 食品的气味做出客观的评价。泡菜的口感是泡菜品质的重要体现，一般来说， 酸辣可口，同时苦涩味较少的泡菜的品质较好。为确 定分离到的乳酸菌的泡菜发酵特性，采用电子舌技术 对泡菜水样品的滋味指标进行了评价。

3 结论

从湖北恩施州咸丰地区采集的 5 份鲊广椒样品中 共分离得到了 20 株乳酸菌，均鉴定为植物乳杆菌。使 用所分离到的乳酸菌进行了豇豆泡菜的发酵制作，并 对豇豆泡菜水品质进行了品质评价，结果显示使用乳 酸菌 HBUAS51141 和 HBUAS51156 发酵的泡菜水中 乳酸含量高达 9.20 g/L 以上，同时苦涩味较轻，是豇豆 泡菜复合发酵剂开发的优良候选菌株。

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