复合乳酸菌发酵蛋壳制备乳酸钙-GHP-9160使用

我国是世界禽蛋生产和消费第一大国，每 年废弃的鸡蛋壳约 300 万 t ，造成严重的环境污 染和资源浪费。蛋壳钙是一种理想的膳食钙源， 提自蛋壳粉的钙比商业碳酸钙在大鼠小肠中更易吸收。蛋壳钙可用于人体和动物骨矿化和生 长的缺钙治疗 ，以及作为牙膏的抗牙垢剂。 食品工业利用蛋壳钙制备的乳酸钙作为固化剂、调味 剂、膨松剂及抗菌。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鸡蛋壳收集于福建农林大学蛋糕店。蒙氏肠 球菌（Enterococcus mundtii）和保加利亚乳杆菌 （Lactobacillus bulgaricus）为华中农业大学蛋品加工 国家地方工程实验室贮藏，嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus，保藏编号CICC 20382）、干酪乳杆菌 （Lactobacillus casei，保藏编号CICC 20282）购自中国 工业微生物菌种保藏管理中心。 MRS（Man Rogosa Sharpe）、MRS琼脂培养基 青岛 海博生物技术有限公司；钙黄绿素（分析纯） 上海麦 克林生化科技有限公司。

1.2 仪器与设备

YF-150B中药材粉碎机 瑞安市永历制药机械有限 公司；TGL-16冷冻离心机 四川蜀科仪器有限公司； GI65DS高压蒸汽灭菌锅 致微（厦门）仪器有限公司； GHP-9160隔水式恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限 公司；ZWYR-240恒温培养振荡器 上海智诚分析仪器制 造有限公司；AVATAR360傅里叶变换红外光谱仪 美国 尼高力仪器公司；DY5261型X射线多晶衍射仪 美国 CEM公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋壳粉制备

蒸馏水清洗后的蛋壳于70 ℃电热恒温干燥箱中干燥 3 h，随后放入连续式高性能粉碎机中粉碎。将蛋壳粉加 入蒸馏水浸泡，搅拌10 min后静置15 min，除去上液漂浮 的蛋壳膜。蛋壳粉抽滤后在70 ℃干燥3 h，过200 目筛后 收集备用。

1.3.2 培养基与菌种活化

发酵培养基：蛋白胨0.5 g，胰蛋白胨0.5 g，酵母 提取物1.0 g，盐溶液（NaHCO3 10.0 g、NaCl 2.0 g、 无水CaCl 2 0.2 g，K2HPO4 1.0 g、KH2PO4 1.0 g、 MgSO4·7H2O 0.48 g，定容至1 000 mL）4 mL，葡萄糖 12 g，蛋壳粉8 g，蒸馏水100 mL。培养基成分充分混均 后，121 ℃灭菌20 min，蛋壳粉单独灭菌，冷却后备用。 菌种活化：4 株菌种（蒙氏肠球菌、嗜热链球菌、 干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌）分别接种于MRS液体培 养基中，于37 ℃培养24 h，2.0%的接种量传代2～3 次， 直至恢复活力，0～4 ℃冰箱中低温保藏。

1.3.3 理化指标测定

发酵液乳酸钙含量测定：采用的 方 法；发酵液残糖量测定：采用 3,5- 二硝基水杨酸 （3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）比色法；乳酸钙纯度 测定：参照方法。

1.3.4 拮抗实验

将4 种菌两两交叉划线接种于MRS琼脂培养基上， 37 ℃培养24 h，观察十字交叉处是否有被抑制而发生菌 落萎缩和消失的现象。

1.3.5 乳酸菌生长曲线绘制

将活化后的4 种乳酸菌按体积分数2.0%分别接种于 MRS液体培养基中，37 ℃厌氧培养。前12 h每隔1 h测 定一次，后12 h每隔3 h测定一次，菌液稀释10 倍后测 600 nm波长处OD值，连续测定至48 h。MRS液体培养基 为空白对照，绘制乳酸菌生长曲线。

1.3.6 发酵工艺优化

1.3.6.1 复合菌种不同组合对乳酸钙产量的影响

4 种乳酸菌按不同比例相互组合。将各菌液浓度统 一调成1×108 CFU/mL，发酵培养基中依次接入蒙氏肠 球菌、嗜热链球菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌， 接种体积比为1∶1∶1∶1、1∶2∶1∶1、1∶1∶2∶1、1∶1∶1∶2、 2∶1∶1∶1等15 种组合。于37 ℃、180 r/min厌氧发酵72 h， 研究4 种菌不同组合发酵对乳酸钙产量的影响。

1.3.6.2 单因素试验

发酵温度的选择：培养基pH值为7.0，接种量为 8.0%，分别在32、34、37、39、42 ℃，180 r/min厌氧发 酵72 h，考察发酵温度对乳酸钙产量的影响。 发酵时间的选择：培养基pH值为7.0，接种量为 8.0%，于37 ℃、180 r/min条件下厌氧发酵48、54、60、 72、80 h，考察发酵时间对乳酸钙产量的影响。

1.3.7 发酵液中乳酸钙的提取

发酵液含有发酵产物乳酸钙、过剩蛋壳钙、未发 酵残糖、色素、蛋白质等，需对发酵液进行除杂处 理。发酵液离心后取上清液，加入氢氧化钙调pH值至 12～13，80 ℃搅拌30 min。将粗乳酸钙液过滤，pH值调 至4～5，加入3.0%～4.0%的粉末活性炭以吸附色素等杂 质，50～60 ℃静置2 h，真空抽滤滤去活性炭，重复脱色 直至澄清。收集乳酸钙母液旋转蒸发浓缩后，低温冷却 结晶，再将晶体溶于蒸馏水中进行重结晶。加入适量无 水乙醇，洗涤乳酸钙晶体，除去残余的乳酸及表面附着 的其它残留物。将乳酸钙产物于80 ℃干燥8 h，达到质量 恒定即可粉碎、过筛得乳酸钙成品。

1.3.8 产物结构表征

1.3.8.1 傅里叶变换红外光谱分析

将乳酸钙样品和溴化钾粉末于120 ℃干燥4 h， 干燥器中冷却30 min。分别取乳酸钙样品和溴化钾粉 末以1∶100的比例置于玛瑙研钵中充分混合，研磨精细。研磨混匀的粉末加入制样模具中压成几乎呈透明 的圆片后进行红外光谱分析。测定条件：光谱范围 4 000～400 cm－1 ；峰-峰值的噪声为1.3×10－5  Abs/min扫 描；RMS噪声为3.6×10－6  Abs/min扫描。

1.3.8.2 X射线衍射分析

将乳酸钙样品充分干燥后用玛瑙研钵尽可能研细， 然后把试样粉末均匀撒入制样框的窗口中，用玻璃片轻 压制成1.5～2.0 mm足够紧密的平整平面，将乳酸钙制 样框放入试样台进行X射线衍射分析。测定条件：电压 220 V，频率50 Hz，连续扫描，管电流20 mA，管电压 10～40 kV，初始角度10°，终止角度80°。

1.4 数据处理

每组实验重复3 次，采用SPSS 24.0统计软件对数据 进行单因素方差分析ANOVA及显著性差异分析，结果以 ±s表示。利用Origin 2017软件绘图，选用Design-Expert 10.0.7 软件进行响应面分析，P＜0.05，差异显著。

2 结果与分析

4 种乳酸菌的延滞期较短，在接种后 0～4 h开始缓慢生长，该时期内细胞繁殖较慢，数量增长较少。菌体经过较短的延迟期后进入对数生长期，在 4～10 h内生长迅速，呈指数级增长，菌种代谢和繁殖加 快，酶系活跃，代谢旺盛，培养基内菌株生长速率达到 最大。到12 h时总菌数达到较高水平并基本保持不变，进 入稳定期，菌体生长速率变化幅度趋于平稳，活菌数保 持相对稳定，菌落代谢产物不断积累达到最高峰。到20 h 后进入衰亡期，活菌菌体数量逐渐缓慢减少，菌种活性 降低并趋于停滞。随着发酵温度的升高，乳酸钙产量先 升高后下降，发酵温度对乳酸钙产量影响显著。37 ℃时 乳酸钙产量达最大值，残糖量最低，说明复合乳酸菌利 用葡萄糖的效果最好。当培养温度低于37 ℃时，温度过 低，酶活性受抑制，酶促反应减弱，导致菌体生长和代 谢减缓。但温度过高时，会导致菌体蛋白质凝固变性， 核酸降解变性失活，故高于37 ℃后乳酸钙产量降低。 复合乳酸菌的适宜发酵温度为37 ℃。

3 结 论

利用鸡蛋壳为天然绿色钙源通过生物发酵转化制 备乳酸钙，采用复合乳酸菌发酵蛋壳制备乳酸钙，单 因素试验研究了发酵温度、初始pH值、接种量等因素 对乳酸钙产量的影响；在此基础上根据Box-Behnken 试验设计和响应面分析对发酵条件进行优化。结果表 明，复合乳酸菌发酵蛋壳制备乳酸钙的最佳工艺条件 为：发酵温度37 ℃、发酵时间72 h、初始pH 6.5、复合 菌接种量8.0%，在此条件下，乳酸钙产量达（40.01± 0.035）g/L，纯度为92.65%。通过傅里叶变换红外光谱、 X-射线衍射表征了乳酸钙的结构，证实发酵得到的产物 即为乳酸钙。此研究为进一步利用微生物发酵蛋壳制备 乳酸钙的开发利用提供了理论依据，且为鸡蛋壳的综合 利用开辟了可行、有效途径。



 

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