卵巢癌细胞凋亡的影响及机制研究（一恒培养箱

卵巢癌是女性最常见三大恶性肿瘤之一，５年 生存率低于５０％，死 亡 率 居 妇 科 癌 症 首 位，且 近 年来卵巢癌发病率与死亡率有增长的趋势。化疗 是目前治疗卵巢癌的重要手段，然而随着药物的使 用，耐药问题 和 化 疗 毒 副 作 用 日 益 明 显，化 疗 耐 药 成为卵巢癌复发和治疗失败的主要瓶颈，寻找安 全、有效的抗肿瘤的药物势在必行。

１ 材料

卵巢癌细胞株ＳＫＯＶ－３（华 中科技大学同济医学院附属协和医院妇产科实验室 赠 予），胎 牛 血 清 （美 国 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｇｉｂｃｏ 公 司）、 ＤＭＥＭ 高糖培养基（美国ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＧｉｂｃｏ公司），山 萘酚（Ｓｉｇｍａ公 司，纯 度＞９５％），ＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣ／ＰＩ 凋亡检测试剂盒（美国ＢＤ公司），０．２５％胰酶消化液、 Ｎｏｔｃｈ１抗体（ＡＢｃｌｏｎａｌ公司），ＣＯ２培养箱（三洋 ＭＣＯ－ １７５型），超净工作台（苏州安泰 ＨＴ－１３００型），倒置 光学显微镜（日本 ＯＬＹＭＰＵＳ公司）。

２ 方法

２．１ 药物配置

精密称取山萘酚３．０１ｍｇ，溶于５ ｍＬ二甲亚砜并依次用含１０％ 胎牛血清的 ＤＭＥＭ 高糖的细胞培养液稀释成含２０，４０，８０μｍｏｌ·Ｌ－１溶 液，备用。

２．２ 卵巢癌细胞培养及分组

用含１０％ 胎牛血清 的 ＤＭＥＭ 高糖培养基体外培养卵巢癌细胞株 ＳＫ－ ＯＶ－３。将ＳＫＯＶ－３细胞置于恒温培养箱(上海一恒LHS-50CH恒温恒湿培养箱)（５％ ＣＯ２、 ３７ ℃）中孵育，２～３ｄ传代一次，维持细胞处于对数 生长期。倒 置 显 微 镜 下 观 察 细 胞 形 态 变 化 情 况。 将体外培养 的 卵 巢 癌 ＳＫＯＶ－３细胞随机分为空白 对照 组 （０μｍｏｌ·Ｌ－１ ）、ＫＡ 低 剂 量 组 （２０μｍｏｌ· Ｌ－１）、ＫＡ 中剂 量 组（４０μｍｏｌ·Ｌ－１）、ＫＡ 高 剂 量 组 （８０μｍｏｌ·Ｌ－１）。

２．３ ＫＡ 对卵巢癌细胞增殖的影响

２．３．１ ＫＡ 对卵巢癌细胞形态的影响

取 培 养 好 的ＳＫＯＶ－３细胞加入１２孔 培 养 板 中，于５％ ＣＯ２、 ３７℃恒温培养箱中孵育２４ｈ，分别加入含不同质量 浓度 ＫＡ（０，２０，４０，８０μｍｏｌ·Ｌ－１）的培养液，考察不 同质量浓度（０，２０，４０，８０μｍｏｌ·Ｌ－１）ＫＡ 干预４８ｈ 后对卵巢癌细胞ＳＫＯＶ－３形态学的影响。

２．３．２ ＭＴＴ 法 测 定 不 同 质 量

浓 度 ＫＡ 对 卵 巢 癌 细胞活 力 的 影 响 取 培 养 好 的 ＳＫＯＶ－３细 胞 加 入 ９６孔培养板中，于５％ ＣＯ２、３７ ℃恒 温 培 养 箱 中 孵 育２４ｈ，分 别 加 入 含 不 同 质 量 浓 度 ＫＡ（０，２０，４０， ８０μｍｏｌ·Ｌ－１）的 培 养 液，４８ｈ后 考 察 不 同 浓 度 ＫＡ 干预对卵 巢 癌 细 胞 ＳＫＯＶ－３ 存 活 率 的 影 响。每 孔 加入 ＣＣＫ－８溶 液１０μＬ，培 养３ｈ，酶 标 仪４５０ｎｍ 处测定吸光 度（Ａ）值，计算细胞存活率。细 胞 活 力 （％）＝［Ａ（加药）－Ａ（空 白）］／［Ａ（０加 药）－Ａ（空 白）］×１００％。

２．４ 不同质量浓度

ＫＡ 对卵巢癌 ＳＫＯＶ－３细胞凋 亡 的 影 响 采 用 流 式 细 胞 术，按 照 ＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣ／ＰＩ凋亡试剂盒说明书操作，用流式细胞仪检 测不同质量 浓 度 ＫＡ（０，２０，４０，８０μｍｏｌ·Ｌ－１）干 预 ４８ｈ后各组卵巢癌ＳＫＯＶ－３细胞的凋亡情况。

２．５ ＫＡ 对 ＮＩＣＤ ｍＲＮＡ 表达的影响

将培养好 的卵巢癌 ＳＫＯＶ－３细 胞 接 种 在６孔 板 培 养 至 对 数 生长期，加入浓度８０μｍｏｌ·Ｌ－１的 ＫＡ，对照组加入 等体积的含１０％胎 牛 血 清 的 ＤＭＥＭ 高 糖 培 养 基， 培养４８ｈ。提取 ＲＮＡ：用４ ℃预冷的 ＰＢＳ漂洗细 胞３次后，每孔加入１ｍＬＴｒｉｚｏｌ，吹打后移入ＥＰ管 中，冰上放置５ｍｉｎ后，加入氯仿分 层，冰 异 丙 醇 沉 淀，无水乙醇干燥。ＲＮＡ 定量后，按照试剂盒说明 书操 作，ＲＴ－ＰＣＲ 反 应 条 件：９５ ℃ １０ｓ１ Ｃｙｃｌｅ； ９５ ℃ ５ｓ，６０ ℃ ２０ｓ，４５Ｃｙｃｌｅ。引物：ＮＩＣＤ 上游 ５′－ＧＴＣＡＡＣＧＣＣＧＴＡＧＡＴＧＡＣＣＴ－３′，下 游 ５′－ ＴＴＧＴＴＡＧＣＣＣＣＧＴＣＴＴＣＡＧ－３′。实验重复３次。

２．６ ＫＡ 对 Ｎｏｔｃｈ１蛋白表达的影响

将培养好的 卵巢癌细胞，加入８０μｍｏｌ·Ｌ－１的 ＫＡ，对照组加入 等体积的含１０％胎 牛 血 清 的 ＤＭＥＭ 高 糖 培 养 液， 培养４８ｈ。按照蛋白提取试剂盒说明书提取蛋白， 并进行定量。蛋白电泳和转膜：将处理好的蛋白上 样，１０％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 分 离 胶 电 泳 后，电 转 移 至 ＰＶＤＦ膜上。免疫反应 ：将膜置于５％ ＢＳＡ 封闭液 中封闭１ｈ后，与多克隆兔抗人 Ｎｏｔｃｈ１抗体孵育， ４ ℃冰箱过夜；次日用 ＴＢＳＴ 洗膜３次，与辣根过氧 化物酶标记的山羊抗ＩｇＧ 二抗孵育１ｈ ，用 ＴＢＳＴ 洗膜３次。显影与凝胶成像系统分析。

２．７ 统计学方法

数据采用 ＳＰＳＳ１７．０软件进行 统计分 析，采 用 单 因 素 方 差 分 析 进 行 检 验，Ｐ＜ ０．０５为差异有显著性。

３ 结果

与 空 白 对 照 组 相 比，ＫＡ 干 预 ４８ｈ后卵巢 癌 ＳＫＯＶ－３细胞形态发生了显著的变 化，细胞间隙增大，细胞坏死率升高，即随着山萘酚 药物浓度的增加，山萘酚对卵巢癌细胞的增殖呈显 著抑制的状态。与 空 白 对 照 组 相 比，ＫＡ 干 预 ４８ｈ后卵巢 癌 ＳＫＯＶ－３细胞形态发生了显著的变 化，细胞间隙增大，细胞坏死率升高，即随着山萘酚 药物浓度的增加，山萘酚对卵巢癌细胞的增殖呈显 著抑制的状态。

４ 讨论

近年来，由 于 天 然 化 合 物 在 防 癌、抗 癌 方 面 的 毒副作用小，其应用潜力日益受到研究者的关 注。 山萘酚是一种广泛存在于植物根、叶和果实中的黄 酮类化合物，具有多种生物学活性。现代药理研究发现山萘酚 具 有 抗 氧 化、抗 炎、抗 癌 和 预 防 心 血 管 疾病等多种 药 理 活 性，可 用 于 肿 瘤 的 预 防，发 挥 抗增殖、抗氧 化 和 致 癌 阻 断 作 用，调 节 参 与 肿 瘤 发 生发展过程的多种分子信号转导通路等。研 究发现 ＫＡ 是通过多条途径发挥抗肿瘤作用：通过 调控环氧合酶－２的转录、抑制 Ｐ－糖蛋白的功能和表 达、抑制白细胞介素－４抗细胞增殖、诱导细胞凋亡、 干预细胞信号转导和增强抑癌基因活性及抑制癌 基因表达等。



 

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