致龋细菌作用的实验研究

口腔内的绝大多数微生物以牙菌斑生物膜的 形式存在，与浮游菌相比，菌斑生物膜内细菌的毒 力、耐药性和抵抗机械清除的能力均更强，且 使 用机械方法不能完全清除菌 斑 生 物 膜，因此需要联 合抗菌剂进一步控制菌斑。目前临床上最常用和最有 效的抗生素制剂是氯己定 （ｃｈｌｏｒｈｅｘｉｄｉｎｅ，ＣＨＸ）， 但存在降低味觉敏感性、口腔组织色素沉着等副作 用，因此需要寻找长效和副作用比较少的药物来控 制菌斑。

１ 材料与方法

１．１ 药物及试剂

１．１．１ 苦参提取物制备

药物来源：新疆医科大学 天然药物研究重点实验室提供，取干燥苦参药材适 量粉碎过６０目 筛，按 照 料 液 比１∶１０ （ｇ／ｍＬ）溶 于蒸馏水中，于摇床上浸泡２０ｍｉｎ后放入超声振荡 仪中 （８０ ℃、１００％的功率下４５ｍｉｎ），抽滤，将滤 渣进行２次提取，合并２次滤液；将滤液旋转蒸发 浓缩并冷冻干燥 （－８０ ℃），得黄白色粉末，用 蒸馏水配制母液浓度为６４ｍｇ／ｍＬ，过０．２２μｍ 无 菌滤过器避光储存于４ ℃冰箱备用。

１．１．２ 实 验 试 剂

脑 心 浸 液 培 养 基 （ｂｒａｉｎｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ，ＢＨＩ），美国 ＢＤ 公司，Ｌｏｔ号：７０７５６５９； 氯化血 红 素，上 海 源 叶 生 物 科 技 有 限 公 司，ＣＡＳ 号：１６００９－１３；维 生 素 Ｋ１ 注 射 液，遂 成 药 业 股 份 有限公 司，国 药 准 字 号：Ｈ４１０２１０５１；蔗 糖，天 津永晟精细化工有限公司，ＨＧ／Ｔ 号：３４６２－１９９９；结 晶紫，Ｓｏｌａｒｂｉｏ，ＣＡＳ 号：５４８－６２－９；厌 氧 产 气 袋， 型号：ＣＸ－３５，厌氧指示剂，型号：ＣＸ－２２，日本三 菱瓦斯化学株式会社。

１．２ 实验

菌 株、培养基和实验分组 变 形 链 球 菌 （Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ，ＵＡ１５９）、远缘链球菌 （Ｓｔｒｅｐ－ ｔｏｃｏｃｃｕｓｓｏｂｒｉｎｕｓ，ＡＴＣＣ６７１５）、血链球菌 （Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ－ ｃｕｓｓａｎｇｕｉｓ，ＡＴＣＣ１０５５６）、粘性放线菌 （Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｉｓｃｏｓｕｓ，ＡＴＣＣ １９２４６）、内 氏 放 线 菌 （Ａｅｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ，ＡＴＣＣ１２１０４）和嗜酸乳杆菌 （Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌ－ ｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ，ＡＴＣＣ４３５６）购买于美国模式培养物 集存库 （Ａｍｅｒｉｃａｎｔｙｐｅｃｕｌｔｕｒｅｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）。将标准菌株 接种 于 ３ ｍＬ 液 体 培 养 基 中，８０％ Ｎ２、２０％ ＣＯ２、 ３７℃恒温培养箱培养４８ｈ，将各复苏菌株接种于ＢＨＩ 或 ＭＲＳ琼脂平板上，８０％ Ｎ２、２０％ ＣＯ２、３７℃厌氧 培养２４ｈ，涂片检查为纯培养后，分光光度计调定菌 悬液浓度分别为浮游菌实验为１０６ ＣＦＵ／ｍＬ （Ａ６００ ＝ ０．２）、生物膜实验为１０７ ＣＦＵ／ｍＬ （Ａ６３０＝０．２）。用 含 １％蔗糖的ＢＨＩ或 ＭＲＳ液体培养基将母液按二倍梯 度稀释法稀释作为实验组；不加药液的培养基为阴 性对照组 （ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ＮＣ）；０．５ｇ／Ｌ 的 ＣＨＸ为阳性对照组。

１．３ 仪器

洁净工作台，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；紫外可见分光光度计，上海棱光技术有 限公司；Ｂｉｏ－ｒａｄ酶 标 仪，美 国 伯 乐；密 封 培 养 罐， 日本三菱瓦斯化学株式会社；电热恒温培养箱，上 海一恒科技有限公司；电子天平，ＭＥＴＴＬＥＲＴＯ－ ＬＥＤＯ；ＥＹＥＬＡ 冷 却 水 循 环 装 置，油 浴 锅，ＥＹＥ－ ＬＡ 旋转蒸发仪；离心机，Ｓｉｇｍａ。

１．４ 方法

１．４．１ 苦参提取

物 对 浮 游 菌 生 长 抑 制 试 验 根 据 Ｗｉｅｇａｎｄ等研 究 方 法，于 无 菌 试 管 中 分 别 加 入 １ｍＬ菌悬 液 及 １ ｍＬ 梯 度 稀 释 含 药 培 养 基，８０％Ｎ２、２０％ ＣＯ２、３７ ℃ 培 养 ２４ｈ，在 黑 背 景 下，以 肉眼观察未见浑浊的最低药物浓度为药物的最低抑 菌浓度 （ｍｉｎｉｍｕｍｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ＭＩＣ）， 将未浑浊的试管中的培养基分别接种于琼脂固体培 养皿上，３７ ℃厌氧培养２４ｈ，观察细菌 生 长 情 况， 无细菌生长的最低药物浓度为该药的最低杀菌浓度 （ｍｉｎｉｍｕｍｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ＭＢＣ）。

１．４．２ 苦参提取物对浮游菌黏附抑制试验

细菌黏 附试验采用分光光度比浊法测定，于无菌试管中 分别加入１ｍＬ的菌悬液，再分别加入２ｍＬ１ ＭＩＣ 值以下的４个药物浓度 （包含１ＭＩＣ），将试管与水 平 面 成 ３０°放 置，８０％ Ｎ２、２０％ ＣＯ２、３７ ℃ 培 养 ２４ｈ。将培养好的试管 （试管１）轻柔旋转３圈后， 菌液倒入另一无菌试管 （试管２），从试管１无黏附 侧加入３ｍＬ磷酸盐缓冲溶液 （ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｓａ－ ｌｉｎｅ，ＰＢＳ），轻柔 旋 转３圈 后，洗 脱 液 倒 入 另 一 无 菌试管 （试管３），试管２和３分别８０００ｒ／ｍｉｎ （离 心半径８ｃｍ，下同）离心１５ｍｉｎ，弃上清液，在试 管１、２和３中分别加入３ｍＬＰＢＳ缓冲液，震荡混 匀。使用紫外分 光 光 度 计 在５４０ｎｍ 处，以 ＰＢＳ缓 冲液为空白对照组，测定各试管的吸光度 （Ａ）值， 实验重复３次取平均值。细菌黏附比＝Ａ１／ （Ａ１ ＋Ａ２ ＋ Ａ３）×１００％，黏附抑制 率＝ （阴性对照组黏附率－实 验 组 黏附率）／阴性对照组黏附率×１００％。

１．４．３ 苦参提取物对浮游菌产酸抑制试验

１ ＭＩＣ 值以下的４个苦参提取物药物浓度 （包含１ ＭＩＣ）， 按体积比为１０∶１接种等量菌悬液于无菌试管 中， 调定其初始 ｐＨ＝７．０，８０％ Ｎ２、２０％ ＣＯ２、３７ ℃ 培养２４ｈ 后 于 冷 冻 离 心 机 ８０００ｒ／ｍｉｎ４ ℃ 离 心 ３０ｍｉｎ，电子ｐＨ 计 测 定 上 清 液 ｐＨ 值，实 验 重 复 ３次。ΔｐＨ＝初始ｐＨ 值－终末ｐＨ 值。

１．４．４ 苦 参 提 取 物

对 浮 游 菌 水 不 溶 性 胞 外 多 糖 （ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，ＥＰＳ）抑制试验 按照苯酚－ 硫酸法测定葡聚糖标准曲线。细菌干预步骤同 １．４．３，培养２４ｈ后于冷冻离心机８０００ｒ／ｍｉｎ４ ℃ 离心３０ｍｉｎ，弃上清 液，各 加 入５．０ｍＬ 无 菌 水 洗 涤，离心２次 （１２０００ｒ／ｍｉｎ，４ ℃，３０ ｍｉｎ），水 洗后的 沉 淀 用 ０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ 重 悬，离 心 ２ 次 （１２０００ｒ／ｍｉｎ，４ ℃，３０ ｍｉｎ），合 并 上 清 液，过 ０．２２μｍ 硝酸纤维素滤膜，加入３倍体积冷９５％乙 醇溶液，４℃下过夜沉淀ＥＰＳ，加入冷５％苯酚、浓 硫酸和 ＥＰＳ溶液 （体积比为１∶５∶１），于４９０ｎｍ 处测Ａ 值，实验重复３次。

１．４．５ 苦参提取物对单菌生物膜的抑制试验

９６孔 板中分别加入实验菌悬液５０μＬ和１５０μＬ已梯度稀释的 含 药 培 养 基， 封 口 膜 密 封， 摇 床 震 荡 培 养 ３０ｍｉｎ后８０％ Ｎ２、２０％ ＣＯ２、３７ ℃培养２４ｈ，吸 出９６孔板 中 上 清 液，无 菌 ＰＢＳ 洗 ２ 次 去 浮 游 菌， ４％多聚甲醛固定１５ｍｉｎ后用鼓 风 干 燥 箱 干 燥，加 入０．１％结晶紫染色５ｍｉｎ，ＰＢＳ每孔清洗３次，室 温下干燥，每孔加入２００μＬ９５％乙醇，于微量振荡 器上 震 动 ３０ ｍｉｎ，将 乙 醇 复 吸 至 另 一 ９６ 孔 板 中， 用酶标仪在Ａ５９５ｎｍ处读数，实验重复３次。抑 制 率＝ （Ａ５９５阴 性 对 照组 － Ａ５９５实 验组 ）／Ａ５９５阴 性 对 照 组 × １００％； ＭＢＩＣ８０ （８０％ ｏｆｍｉｎｉｍｕｍｂｉｏｆｉｌｍｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ， ＭＢＩＣ８０）为抑制８０％以上的生物膜形成的最低药物 浓度。

１．４．６ 苦参提取物对单菌生物膜最低清除浓度的试验

９６孔板中分别加入实验菌悬液５０μＬ和液 体培养基１５０μＬ，３７ ℃厌氧培养２４ｈ形成生物膜。 吸出９６孔板中上清液，ＰＢＳ洗去浮游菌后加入已梯 度稀释的２００μＬ 含 药 液 体 培 养 基 进 行 干 预。方 法 一：３７ ℃ 厌 氧 培 养 ２４ ｈ， 其 余 步 骤 同 １．４．５， ＭＢＥＣ 为 Ａ 值 突 然 升 高 前 的 临 界 值。 方 法 二： ３７ ℃厌氧培养２４ｈ后，将培养液接种于 ＢＨＩ琼脂 培养皿 上，３７ ℃厌 氧 培 养２４ｈ，观 察 细 菌 生 长 情 况，无细菌 生 长 的 最 低 药 物 浓 度 为 该 药 的 ＭＢＥＣ， 实验重复３次。

１．４．７ 苦参提取物对单菌生物膜产酸抑制试验

将 直径１５ｍｍ 无菌细胞培养盖玻片置入２４孔 细 胞 培 养板 中，每 孔 加 入 ５００μＬ 菌悬液和液体培养基 １５００μＬ，３７℃厌氧培养２４ｈ形成生物膜；吸出上 清液，无菌 ＰＢＳ洗２次去浮游菌，加入已梯度稀释 的２０００μＬ 含 药 液 体 培 养 基 （ｐＨ＝７．０） 干 预， ３７ ℃厌氧培养 ２４ｈ 后 吸 出 ２４ 孔板内的培养基于 ２ｍＬＥＰ管中，其余实验步骤同１．４．３，测ｐＨ 值； 实验重复３次。

１．４．８ 苦参提取物对单菌生物膜水不溶性

ＥＰＳ抑 制试 验 药 物 干 预 生 物 膜 的 实 验 步 骤 同 １．４．７， ３７ ℃厌氧培养２４ｈ后吸出２４孔板内的培养基，无 菌 ＰＢＳ洗２次去浮游菌，用无菌刀片将菌膜轻轻刮 至 ２．０ ｍＬ ＥＰ 管 中， 无 菌 水 洗 涤， 其 余 步 骤 同 １．４．４，测Ａ 值；实验重复３次。

２ 结 果

６种细菌的 ＭＩＣ值均为４ｇ／Ｌ，嗜 酸 乳 杆 菌 的 ＭＢＣ 为４ｇ／Ｌ， 其余５种细菌均为８ｇ／Ｌ。见表１。
苦参提取物 在浓度为２ｇ／Ｌ时表现出明显的抑制，变形链球菌 （Ｆ＝９６８．４，Ｐ＜０．００１）、远缘链球菌 （Ｆ＝４７０．５， Ｐ＜０．００１）、血 链 球 菌 （Ｆ＝４２９．３，Ｐ＜０．００１）、 粘性放线菌 （Ｆ＝２２２４．０，Ｐ＜０．００１）和内氏放线 菌 （Ｆ＝９０４．９，Ｐ＜０．００１），并在１ ＭＩＣ 时对上述 细菌的黏附抑制 率分别为 （７７．６％ ±１．２％）、 （６６．７％±１．８％）、（６０．６８％±２．９％）、（７９．８％±１．２％）和 （８５．１％ ±１．３％），浓 度 在 ０．５ｇ／Ｌ 和 １ｇ／Ｌ时对变形链球菌的黏附抑制差异没有统计学意 义 （Ｐ＝０．０８４），其 他 各 组 内 比 较 差 异 均 有 统 计 学 意义 （Ｐ＜０．０５），见图１。


3 讨 论

通过本实验发现苦参提取物对主要 致龋细菌的 ＭＩＣ为４ｇ／Ｌ，在此浓度下抑制口腔主 要致龋菌黏附率达６０％以上，并明显抑制浮游细菌 产酸及合成水不溶性 ＥＰＳ。在１ ＭＩＣ浓度下能明显 抑制主要致龋细菌的单菌生物膜形 成能力并优于 ０．５ｇ／ＬＣＨＸ；２ ＭＩＣ 浓度下对变形链球菌和内氏 放线菌的单 菌 生 物 膜 清 除 能 力 优 于０．５ｇ／ＬＣＨＸ， 达到７０％左右，而其余细菌是在４ＭＩＣ浓度下单菌 生物膜的清除能力优于０．５ｇ／ＬＣＨＸ，达到８０％以 上。在１ＭＩＣ浓度下均能抑制单菌生物膜产酸和合成 水不溶性ＥＰＳ，２ＭＩＣ浓度下明显抑制单菌生物膜产 酸和合 成 水 不 溶 性 ＥＰＳ，抑制 率 分 别 为 ６４．５％ ～ ９４．１％和４２．３％～６０．０％。