藏羊MIF基因的序列测定与分析-LRH-100CL使用

藏羊是青藏高原特有的物种，生活在青海省的黄 南、果洛、玉树、海北、海南、海西等高寒高海拔地区， 具有一定的抗寒抗病能力。巨噬细胞的移动抑制 因子( MIF) 最初作为 T 淋巴细胞的激活产物被发现， 因其在体外可以抑制巨噬细胞的移动而得名。胰 岛 β 细胞通过分泌 MIF 来促进胰岛素的释放，从而 影响血糖代谢。

1 材料

1. 1 试验样品

健康高原型藏羊脾脏组织，青海大学农牧学院动 物医学系预防兽医学实验室采集并冷冻保存。

1. 2 主要试剂

组织 ＲNA 提取试剂盒，购自北京艾德莱生物科 技有 限 公 司; Prime Script 反 转 录 试 剂 盒、Premix TaqTM、DL－2 000 Marker，均购自宝生物工程( 大连) 有限公司。

1. 3 主要仪器

高速离心机( 型号为 SIGMA1 － 14) ，购自德国 Sigma 公司; PCＲ 仪( 型号为 T100) ，购自伯乐公司; 电子天平( 型号为 AL104) ，购自梅特勒－托利多仪器 有限公司; 生化培养箱( 型号为 LＲH－100CL) ，购自 上海一恒科技有限公司。

2 方法

2. 1 引物的设计与合成

根据 NCBI 数据库中登录的绵羊参考序列，设计 藏羊 MIF 基因的 PCＲ 引物。引物序列( 登录号为 DQ414692. 1) 为 MIF－F 5' －ATGCCGATGTTCGTGGTGAA－3'; MIF－Ｒ 5'－TCAGGCGAAGGTGGAGCC－3'。

2. 2 总 ＲNA 的提取

按照试剂盒说明书进行操作。

2. 3 ＲT－PCＲ 扩增

反转录 cDNA: 取总 ＲNA 5 μL，下游引物 2 μL， dNTP Mixture 2 μL，ddH2O 1 μL，65 ℃ 恒 温 水 浴 5 min，迅速于冰盒中冷却 2 min; 加入 5×反转录缓冲 液 4 μL，ＲNA 酶 抑 制 剂 0. 5 μL，反 转 录 酶 1 μL， ddH2O 4. 5 μL，充分混匀，于 42 ℃ 温箱中反应 40 ～ 60 min，70 ℃水浴 15 min，冷却后保存，备用。 PCＲ 扩增体系: 预混液( PCＲ Buffer、dNTPs、DNA 聚合酶) 25 μL，cDNA 5 μL，上 下 游 引 物 各 1 μL， ddH2O 18 μL。PCＲ 扩增 程 序: 94 ℃ 1 min，62 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，35 个循环; 72 ℃ 10 min。反应结束 后－20 ℃保存，备用。

2. 4 核苷酸序列测定与分析

将琼脂糖凝胶电泳检测正确的 PCＲ 扩增产物送 至生物工程( 上海) 股份有限公司进行测序，采用 DNAStar 软件进行 MIF 基因序列分析。

2. 5 蛋白质特性分析

分别应用 DNAStar、SignalP、TMHMM、I －Tasser、 Predictprotein 等软件对 MIF 蛋白的二级结构、亲水 性、柔韧性、表面可及性、信号肽、跨膜螺旋区、修饰位 点等蛋白特性进行分析。

3 结果与分析

藏羊 MIF 基因 ＲT－PCＲ 产物经 1%琼脂糖凝胶 电泳检测，结果 MIF 基因所在泳道出现与预期大小 相符的目的基因条带( 348 bp) 且条带清晰，见图 1。

将藏羊 MIF 基因与绵羊( 登录 号 为 NM001033608. 1 ) 、 瘤 牛 ( 登 录 号 为 XM019977119. 1) 、普通牛( 登录号为 HF564807. 1) 、 水牛( 登录号为 XM_006048115. 2) 和山羊( 登录号: XM018060897. 1) 进行同源比对，结果核苷酸同源性 依次为 100%、99. 7%、99. 7%、99. 4%和 100%，蛋白 氨基酸同源性皆为 100%。蛋白修饰位点分析结果显示: 藏羊 MIF 蛋白含 有 2 个 N－糖基化位点，分别为 73 ～ 76 位的 NＲSY、 110 ～ 113 位的 NGST; 2 个蛋白激酶 C 位点，分别为 31 ～ 33 位的 TGK、85 ～ 87 位的 TEＲ; 1 个酪蛋白激酶 Ⅱ磷酸化位点，为 14 ～ 17 位的 SVPD; 1 个酪氨酸激 酶磷酸化位点，为 89 ～ 96 位的 ＲISPDＲIY; 1 个 N －肉 豆蔻酰化位点，为 69 ～ 74 位的 GGAQNＲ; MIF 家族为 55 ～ 69 位的 EPCALCSLHSIGKIG。

4 讨论 

MIF 作为血管形成因子 既能促进小鼠体内微血管的形成，也能促进人体新生 微血管的形成，这也提示藏羊 MIF 基因可能具有促 进藏羊微血管形成的作用。MIF 在脓毒症的发病机 制中起着不同作用: 一方面毒素、细菌等诱导巨噬细 胞、T 细胞等组织器官产生 MIF，发挥对病原菌的免 疫作用; 另一方面，高水平的 MIF 会加重脓毒症的 器官损伤。赵喆等研究结果表明，当小鼠处于 重物坠落时所致的脊髓损伤急性期时，MIF 在参与脊 髓损伤与修复过程中发挥重要的作用。此外，MIF 与 佐剂性关节炎、胃癌、类风湿性关节炎、乳 腺癌等的发生都有密切的关系。