五氯柳胺混悬液抗菌性的研究

在国外，五氯柳胺作为抗寄生虫药物被广泛应用于牛 羊肝片吸虫的防治。国内的生产厂家尚未取得五氯柳胺的 生产资质，各研发机构、单位也未获得该产品的专利权，此 药在我国尚属二类新药。目前，五氯柳胺的研发仍处于初 级阶段，药物作用机制尚未清楚，大量的研发有待完善。笔 者等对五氯柳胺的抗菌研究进行了初步的探索，以期为相 关研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

参照《中华人民共和国药典》（2015 版）分别 选取大肠埃希菌 CMCC（B）44102、金黄色葡萄球菌 CMCC （B）26003、铜绿假单胞菌 CMCC （B）10104、白色念珠菌 CMCC（F）98001、黑曲霉 CMCC（F）98003 五种标准菌 株 ， 均购自中国兽医药品监察所。

1.1.2 试剂

胰酪大豆胨液体培养基（TSB）（产品批号： 1073051）、沙氏葡萄糖液体培养 基（SDB）（产 品 批 号 ：1073051）、酪胨大豆琼脂培养基（TSA）（产品批号：1073191）、 沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）（产 品 批 号 ：1072401）均 购自广东环凯微生物科技有限公司，培养基适用性检查结 果均符合《中华人民共和国药典》要求；五氯柳胺混悬液 （规格 3.4 mg/mL，产品批号：20180726，中国农业科学院兰 州畜牧与兽药研究所研制）；氯化钠（批号：L218041910）购 自四川科伦药业股份有限公司。

1.1.3 仪器

SW-CJ-2FD 型双人单面净化工作台；隔水式恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；优普超纯水 制造系统；THOMAS 细胞密度计；比色杯（光径为 10 mm）；恒 温振荡器；KQ3200DE 数控超声波清洗器；DHG-9240A 电 热恒温鼓风干燥箱；海尔冰箱；LDZM-60KCS-Ⅱ立式压力 蒸汽灭菌器 （上海申安医疗器械厂）；BSA423S-CW 天平 （sartorius）；牛 津 杯（外 径 7.8 mm）；游 标 卡 尺 ；玻 璃 涂 布 器；三角瓶等。

1.2 方法

1.2.1 菌株培养与活化方法

将标准菌株大肠埃希菌 CMCC（B）44102、金黄色葡萄球菌 CMCC（B）26003、铜绿假 单胞菌 CMCC（B）10104 接种于胰酪大豆胨液体培养基，35 ℃ 震摇速率 220 r/min。白色念珠菌 CMCC（F）98001 接种于 沙氏葡萄糖液体培养基，25 ℃震摇速率 220 r/min 培养， 传代培养至第 2 代，将菌株培养到第 3 代后即活化完成。 在培养第 3 代菌株时，先把第 2 代菌株的菌悬液稀释到适 宜浓度后接种到固体琼脂培养基上，挑取单个菌落。产孢 子繁殖的真菌黑曲霉 CMCC （F）98003 在沙氏葡萄糖琼脂培养基中培养至第 3 代，即完成活化。

1.2.2 光电比浊法

分别挑取大肠埃希菌 CMCC（B） 44102、金黄色葡萄球菌 CMCC（B）26003、铜 绿 假 单 胞 菌 CMCC（B）10104 的单个菌落接种于胰酪大豆胨液体培养 基，按“1.2.1”方法中的条件培养，在不同的时间点测定菌 悬液的 OD 值，同时用生理盐水稀释菌悬液至适当的浓度 后，按《中华人民共和国药典》（2015 版）附录 1105 平皿法 计数并记录数据。挑取白色念珠菌 CMCC（F）98001 的单个 菌落接种于沙氏葡萄糖液体培养基中，按“1.2.1”方法中 的条件培养，在不同的时间点测定菌悬液的 OD 值，同时用 0.9%无菌氯化钠溶液稀释菌悬液至适当的浓度，按《中华人 民共和国药典》（2015 版）附录 1105 平皿法计数并记录数据。 黑曲霉 CMCC（F）98003 孢子呈黑色，吸光度过大，首先进 行预实验，最终在预实验中选取 OD 值为 1.0 时进行实验 并记录数据。

1.2.3 标准曲线的绘制

分别以时间为横坐标、OD 值为 纵坐标绘制大肠埃希菌 CMCC（B）44102、金黄色葡萄球菌 CMCC（B）26003、铜绿假单胞菌 CMCC（B）10104 和白色念 珠菌 CMCC（F）98001 的生长曲线。

1.2.4 抑菌效力的测定

通过标准菌株生长曲线测定及 黑曲霉预实验，确定大肠埃希菌 CMCC（B）44102、金黄色 葡萄球菌 CMCC（B）26003、铜绿假单胞菌 CMCC（B）10104、 白色念珠菌 CMCC（F）98001 和黑曲霉 CMCC（F）98003 的 时间、OD 值与 CFU 值的关系，把目标浓度 105 ~106 CFU/mL 的菌悬液接种于供试品中，以无原药的混悬剂溶剂做空白 对照，参考《中华人民共和国药典》（2015 版）接种的菌悬 液的体积小于或等于供试品液体体积的 1%，且大肠埃希 菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌在供试品中接种后的 CFU 值为每毫升 106 数量级，白色念珠菌和黑曲霉在供试 品中接种后的 CFU 值为每毫升 105 数量级。

1.2.5 五氯柳胺混悬液的抗菌性

牛津杯法。制备胰酪 大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基平皿（9 mm）； 制备适宜浓度的大肠埃希菌 CMCC（B）44102、金黄色葡萄 球菌 CMCC（B）26003、铜 绿 假 单 胞 菌 CMCC（B）10104、白 色念珠菌 CMCC（F）98001 和黑曲霉 CMCC（F）98003 的菌 悬液。取等量的菌悬液，用三角玻璃涂布器分别均匀地涂 在培养基平皿上，即完成菌板的制作。把无菌牛津杯垂直 放置在菌板上，轻轻按压，向牛津杯中加入 100 μL 与国外 相同产品规格的 3.4 mg/mL 五氯柳胺混悬液，以常用抗菌 药氨苄西林为阳性对照，以无试验原药的混悬剂溶剂做空 白对照，按照《中华人民共和国药典》（2015 版）规定，将胰 酪大豆胨琼脂培养基制成的菌板置于 35 ℃恒温培养箱培 养 24 h；用沙氏葡萄糖琼脂培养基制成的菌板至于 35 ℃ 恒温培养箱中培养 48 h，适当延长黑曲霉的培养时间， 直至长出孢子。另外，以二甲基亚砜（DMSO）为溶剂制备 1 mg/mL 五氯柳胺溶液，以等量的二甲基亚砜做空白对 照，重复以上步骤。最后，用游标卡尺测量抑菌圈的直径 （D 值）。

2 结果与分析

图1、图 2、图 3、图 4 分别是大肠埃希菌 CMCC（B） 44102、金黄色葡萄球菌 CMCC（B）26003、铜 绿 假 单 胞 菌 CMCC（B）10104 和白色念珠菌 CMCC（F）98001 的生长曲 线。由图 1 可知，大肠埃希菌 CMCC（B）44102 在 2.5~4.5 h， 生长曲线呈快速上升趋势，此时细菌生长最为迅速，为对 数生长期；4.5 h 后曲线基本处于水平状态，细菌生长缓 慢，为稳定期。由图 2 可知，金黄色葡萄球菌 CMCC（B） 26003 在 4.0~5.5 h，曲线呈快速上升趋势，此时细菌生长 最为迅速，为对数生长期；由图 3 可知，铜绿假单胞菌 CMCC（B）10104 在 4.5~7.0 h，曲线呈快速上升趋势，细菌 生长最为迅速，为对数生长期；由图 4 可知，白色念珠菌 CMCC（F）98001 在 8.0~12.0 h，曲线呈快速上升趋势，此 时真菌生长最为迅速，为对数生长期。 黑曲霉 CMCC（F）98003 的预实验结果 OD 值为 1.0 时， CFU 值的数量级为每毫升 107 ，符合《中华人民共和国药典》 （2015 版）供试品中接种量的要求即开始正式实验。

3 讨论

微生物生长曲线的测定具有很强的理论性和实际应用性，应选择适宜的生长曲线测定方法。一般的菌种生长 曲线为“S”型，生长时间初期与后期的菌株活力较弱，应 选用正处于对数期即以指数倍增期的“种苗菌”为传代菌 源，进行接种培养。发现五氯柳胺混悬液具有抗菌作用且活性 优良，对大肠埃希菌 CMCC （B）44102、金黄色葡萄球菌 CMCC（B）26003、铜绿假单胞菌 CMCC（B）10104、白色念珠 菌 CMCC（F）98001 和黑曲霉 CMCC（F）98003 比较敏感，具 有进一步开发成抗菌药物的潜力。据报道，五 氯柳胺不仅对普通菌种有抑制活性，对耐药菌中也具有抑 制活性。我国国内还没有五氯柳胺的抗菌活性方面的报 道，期望通过本次试验研究，为后续的工作提供参考，为以 后抗菌药物的研发提供新思路及技术支持。