上海一恒恒温培养箱用于异叶败酱化学成分分析

异叶败酱 Patrinia heterophylla Bunge 是败酱科 败酱属多年生草本植物，其根茎或根与糙叶败酱的 根茎或根混用，药材名墓头回。文献报道墓头 回对各类急慢性白血病细胞有抑制作用，并且临床 上用于治疗白血病。异叶败酱作为墓头回的药 源植物，对其化学成分报道较少，为进一步明确异 叶败酱中的药效物质基础，本实验对异叶败酱进行 化学成分研究，并对其单体化合物进行抗肿瘤活性 筛选。从中分离得到 7 个化合物，化合物 2 ～ 6 均 为首次从该属植物中分离得到，化合物 1 为首次从 该植物中分离得到，化合物 1 ～ 6 对白血病细胞有 一定的抑制作用。

1 仪器与材料

高效 液 相 色 谱 仪 ( 日 本 Hitachi 公 司 ) ; 2000ES 蒸发光散射检测器 ( 美国 Altech 公 司) ; Ｒ1-102 示差检测器 ( 日本 Shodex 公司) ; NP7000 半制备液相泵 ( 汉邦公司) ; Ｒ200 旋转蒸发仪、 中压反相色谱柱 ( 瑞士 Buchi 公司) ; Bruker AV- Ⅲ HD 600 超导核磁共振仪 ( 瑞士 Bruker 公司) ; Q-TOF 高分辨质谱仪 ( 美国 Sciex 公司) ; YT-CJ1ND 超净工作台 ( 北京亚泰科隆技术有限公司) ; 上海一恒LHS-50CH恒温恒湿培养箱 ; DT5-2 离心机 ( 北京时代北利离心机有限公司) ; 1420-012 酶 标 仪 ( 美 国 Perkin Elmer 公 司) ; ECLIPSE TS100 显微镜 ( 日本 Nikon 公司) ; D-101 大孔树脂 ( 天津南开和成科技有限公司) ; 薄层层 析硅胶 GF254、柱层析硅胶 100 ～ 200 目 ( 青岛海洋 化工厂) 。分析纯石油 醚、氯 仿、丙 酮、乙 酸 乙 酯、正丁醇和甲醇等试剂 ( 国药集团化学试剂有 限公司) ; 色谱纯甲醇、乙腈 ( 国药集团化学试剂 有限公司) ; 娃哈哈纯净水 ( 杭州娃哈哈公司) 。 ＲPMI 1640 培养基 ( 美国 Gibco 公司) ; 胎牛血清 ( 美国 HyClone 公司) ; 二甲基亚砜 ( 美国 Amresco 公司) ; CCK-8 试剂盒 ( Biosharp 生物科技公司) 。 异叶败酱于 2014 年采于河南省，经中国人民 解放军总医院刘萍研究员鉴定为正品。 人早幼粒白血病细胞 ( HL-60) 、人慢性粒细 胞白血病细胞 ( K562) 均购于中国医学科学院肿 瘤医院细胞中心。

2 提取与分离

干燥的异叶败酱全草 ( 2 kg) 粉碎，75%乙醇 回流提取 3 次，过滤后减压浓缩得异叶败酱总浸 膏。总浸膏加水成悬浮液，依次用石油醚、氯仿、 乙酸乙酯、正丁醇各萃取 3 次，取有机相层，用旋转蒸发仪减压浓缩，回收溶剂，分别得石油醚、氯 仿、乙酸乙酯、正丁醇部位 63、112、36、95 g。 取正丁醇部分用大孔树脂色谱进行分离，依次用 30%、60%、95%乙醇进行梯度洗脱，减压浓缩后 得到 30%、60%、95%部分浸膏。 将 30%部分浸膏 ( 50 g) 经硅胶柱 ( 100 ～ 200 目) 分离，以氯仿-甲醇-水 ( 25 ∶ 1 ∶ 0、9 ∶ 1 ∶ 0、 9 ∶ 1 ∶ 0. 1、8 ∶ 2 ∶ 0. 2、7 ∶ 3 ∶ 0. 5) 梯度洗脱， 共得到 263 个馏分 A1－263，通过薄层色谱检测，合 并相同馏分。馏分 A180－190 合并后经硅胶柱，以氯 仿-甲醇-水 ( 9 ∶ 1 ∶ 0. 1、8 ∶ 2 ∶ 0. 2) 梯度洗脱， 再经半 制 备 HPLC ( 乙 腈-水 2 ∶ 8) 得 化 合 物 1 ( 21. 5 mg) 。馏分 A120－159合并后经中压反相柱以乙 腈-水 ( 1 ∶ 9、3 ∶ 17、1 ∶ 4、1 ∶ 3、3 ∶ 7) 梯度洗 脱，得化合物 2 ( 12. 1 mg) 。 将 60%部分的浸膏经硅胶柱色谱 ( 100 ～ 200 目) 分离，经氯仿-甲醇-水 ( 9 ∶ 1 ∶ 0. 1、8 ∶ 2 ∶ 0. 2、7 ∶ 3 ∶ 0. 5) 梯度洗脱，共得到 245 个馏分 B1－245，通过薄层色谱检测，合并相同馏分。馏分 B93－100合并后经中压反相柱以甲醇-水 ( 5 ∶ 95 ～ 55 ∶ 45) 梯度洗脱得化合物 3 ( 11 mg ) 。馏 分 B60-70号合并后经中压反相柱以乙腈-水 ( 3 ∶ 97 ～ 48 ∶ 52) 梯度洗脱，F23 重结晶得化合物 4 ( 16. 4 mg) ，F26 重结晶得化合物 5 ( 9. 1 mg ) 。馏 分 B77-91号合并后经中压反相柱以甲醇-水 ( 5 ∶ 95 ～ 80 ∶ 20) 梯度洗脱，F30 重结晶得化合物 6 ( 8. 8 mg) ，F40 重结晶得化合物 7 ( 10. 6 mg) 。

3 结构鉴定化合物

 白色粉末 ( 甲醇) 。ESI-MS m /z: 485 ［M + Na］+ 。1 H-NMＲ ( 600 MHz，CD3OD) δ: 1. 78 ( 1H，m，H-13) ，2. 03 ( 2H，m，H-6) ，2. 13 ( 1H，m，H-9) ，2. 19 ( 2H，dd，J = 7. 2 Hz，H-12) ， 2. 95 ( 1H，q，J = 7. 8 Hz，H-8) ，3. 15 ( 1H，t，J = 8. 4 Hz，H-7) ，3. 24 ( 2H，m，H-10) ，4. 04 ( 1H， d，J = 11. 4 Hz，H-1) ，4. 22 ( 1H，m，H-11) ; 13 CNMＲ ( 150 MHz，CD3OD) δ: 93. 5 ( C-1) ，140. 0 ( C-3) ，116. 4 ( C-4) ，34. 1 ( C-5) ，40. 9 ( C-6) ， 73. 3 ( C-7) ，49. 0 ( C-8) ，42. 7 ( C-9) ，62. 2 ( C10) ，69. 6 ( C-11) ，103. 4 ( C-1') ，75. 1 ( C-2') ， 78. 1 ( C-3') ，71. 7 ( C-4') ，77. 9 ( C-5') ，62. 8 ( C6') ，173. 3 ( C-1″) ，44. 1 ( C-2″) ，26. 8 ( 3″) ，22. 6 ( 4″) 。以 上 数 据 与 文 献 一 致，故 鉴 定 为 patrinoside。化合物 2: 黄色粉末 ( 甲醇) 。ESI-MS m /z:677 ［M + Na］+ 。1 H-NMＲ ( 600 MHz，CD3OD) δ: 2. 10 ( 1H，d，J = 16. 8 Hz，H-2) ，2. 47 ( 1H，d，J = 16. 8 Hz，H-2) ，5. 81 ( 1H，quin，H-4) ，4. 36 ( 1H， m，H-9) ，1. 21 ( 3H，d，J = 6. 6 Hz，H-10) ，0. 90 ( 3H，s，H-11) ，0. 91 ( 3H，s，H-12) ，1. 86 ( 3H， d，J = 1. 2 Hz，H-13) ，4. 28 ( 3H，d，J = 7. 8 Hz， Glu-1') ; 13 C-NMＲ ( 150 MHz，CD3OD) δ: 42. 4 ( C1) ，50. 6 ( C-2) ，201. 1 ( C-3) ，127. 1 ( C-4) ， 167. 2 ( C-5) ，79. 9 ( C-6) ，131. 5 ( C-7) ，135. 2 ( C-8) ，77. 2 ( C-9) ，21. 1 ( C-10) ，23. 4 ( C-11) ， 24. 6 ( C-12) ，19. 5 ( C-13) ，102. 7 ( C-1') ，75. 2 ( C-2') ，78. 1 ( C-3') ，71. 6 ( C-4') ，77. 9 ( C-5') ， 62. 8 ( C-6') 。以上数据与文献一致，故鉴定 为 roseoside Ⅱ。 

4 活性测试

将细胞从液氮罐中取出，常规方法复苏，将细胞用含 15% 胎牛血清的 ＲPMI 1640 培养液，在 37 ℃，5%CO2饱和湿度条件下培 养。根据不同细胞的生长速度 1 ～ 2 d 更换新鲜的 培养液或者传代。将处于对数生长期的 HL-60、 K562 细胞制成密度 9×104 /mL、8×104 /mL 的细胞 悬液接种于 96 孔板中，每孔 100 μL，每组设置 5 个平行孔。在培养箱中培养 24 h 后分别加入不同 质量浓度的化合物 1 ～ 6 ( 从低到高依次为 0、20、 40、60、80、100 μg /mL ) 及阳性对照品顺铂 50 μL。给药后继续在培养箱中培养 48 h，取出培 养板，每孔加入 10 μL CCK-8 溶液。1～2 h ( K562 1. 5 h，HL-60 2 h) 后在 450 nm 处测 OD 值。并计 算细胞抑制率及 IC50值。各化合物 的 IC50值见表 1。据相关文献报道，单体化合物 的 IC50＜100 μg /mL，表明实验样品具有明显的细 胞毒活性。结果显示，化合物 1～ 3、5 ～ 6 对 HL-60 细胞具有一定的毒性抑制作用，化合物 2 ～ 6 对 K562 细胞具有一定的毒性抑制作用。

5 讨论

异叶败酱是墓头回最早的药源植物，是历 代本草中以墓头回使用的主流，但是关于异叶败酱 的化学成分报道却很少，目前国内外有 12 个三萜 类、5 个环烯醚萜酯、3 个木脂素、2 个甾体类、3个黄酮类、1 个多糖和 1 个香豆素类化合物的报 道。异叶败酱总皂苷和粗制剂可用于治疗急慢性白 血病、子宫癌、宫颈癌和大肠癌，但是其发挥 药效的确切化合物尚未确定。本研究从异叶败酱中 分离得到 7 个化合物，其中化合物 1 为环烯醚萜 类、化合物 2 为单环降倍半萜苷类、化合物 3 为三 萜皂苷类、化合物 5 为单萜类龙脑苷、化合物 4、 6～ 7 为黄酮类。



 

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