一恒培养箱对于线粒体自噬相关蛋白的表达

0 引言

肾结石是泌尿系统常见的疾病之一，其发病机制较复 杂，然而研究发现纳米细菌(Nanobacteria)感染是诱发结石 形成的一个主要因素。早期研究证实纳米细菌能对肾小管 上皮细胞造成损伤，诱导细胞凋亡.肾小管上皮细胞是机 体含线粒体最丰富的细胞之一，其功能的异常与线粒体关系 密切。线粒体功能障碍及其自噬是肾小管上皮细胞损伤发 生的重要诱导因素，因为线粒体在肾小管上皮细胞能量代 谢、信号传导、细胞增殖等方面发挥重要作用。然而线粒 体自噬是细胞维持线粒体稳态及功能的关键调控机制，其 中同源性磷酸酶张力蛋白诱导的激酶1(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten induced kinase 1，PINK1)/帕金蛋白(Parkin)介导的线粒体自噬是研 究较为明确的信号通路，然而其在纳米细菌介导的线粒体自 噬还有待研究。

1 材料和方法

1.1 设计

细胞学实验观察。

1.2 时间及地点

实验于2017年5月至2018年6月在恩施 土家族苗族自治州中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验用主要试剂和仪器

人肾小管上皮细胞 HK-2(武汉巴菲尔生物公司，上海ACTT细胞库)；DMEM 培养基、磷酸盐缓冲液(PBS)及青链霉素双抗(HyClone公 司)；胎牛血清(FBS，美国Gibco公司)；萝卜硫素(赣州华 汉生物科技有限公司，批号HP302654)；CCK8试剂盒(南 京建成生物公司，批号WS1102367)；Annexin V FITC/PI 凋亡试剂盒(Invitrogen公司，批号P1102532)；兔抗鼠Bax、Bcl-2、PINK1、Parkin、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ及β-actin(美国 KPL公司)；羊抗兔IgG(上海谷歌生物公司)；光学显微镜(日 本 OLYMPUS) ； MultiskanMK2 酶标仪 ( 美 国 Thermo Labsystems)；CytoFLEX流式细胞仪(日本岛津)；VE-186 型转膜仪(美国ORION)；紫外凝胶成像系统(广州市深华生 物科技有限公司)。

1.3.2 纳米细菌

收集恩施土家族苗族自治州中心医院泌 尿外科临床确诊肾结石且未服药或手术患者的尿液，采用 0.45，0.22 μmol/L一次性正压滤器过滤尿液，加入DMEM培 养基后置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱（一恒LHS-50CH恒温恒湿培养箱）中15 h，取对数 期纳米细菌进行后续实验。患者对实验过程完全知情同意。

1.4 实验方法

1.4.1 HK-2细胞培养及分组

HK-2细胞(1×108 L-1细胞浓 度)采用含体积分数10% FBS和1%双抗的DMEM培养液培 养，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中。待细胞处于 对数生长期时(2 d)进行纳米细菌和药物处理。将HK-2细胞 分为3组：对照组(含0.5%二甲基亚砜的完全培养液培养)、 纳米细菌组[给予纳米细菌(细菌浓度为吸光度之0.035)的 完全培养液培养]及萝卜硫素干预组（给予纳米细刺激同时 加30 μmol/L萝卜硫素的完全培养液培养）。取上述3组细胞 进行实验，所有检测指标均在纳米细菌干预细胞24 h后进 行测定，每组均设置6个复孔，实验独立重复3次。

2 结果

不同浓度萝 卜硫素(1，10，20，30，60，90，120 μmol/L)处理细胞 24 h后，发现药物浓度低于60 μmol/L对HK-2细胞毒性和形 态没有明显影响，因此，采用30 μmol/L萝卜硫素进行后续 实验。萝卜硫素干预HK-2细胞24 h，纳米细菌能明显降低HK-2细胞相对存活率，与对照组 相比差异有显著性意义(P < 0.05)；萝卜硫素处理能明显减 弱纳米细菌对HK-2细胞增殖的抑制作用(P < 0.05)。萝卜硫素干预 HK-2细胞24 h后。纳米细菌能明显诱导 HK-2 细胞凋亡，其凋亡率 (49.83±5.87)% 与对照组 (8.64±1.74)%相比差异有显著性意义(P < 0.05)；萝卜硫素 干预组细胞凋亡率(16.07±3.84)%相对于纳米细菌组显著 降低(P < 0.05)。


3 讨论

纳米细菌表现出生物矿化作用，能够在pH 7.4及生理 性钙浓度条件下形成矿化壳黏附于菌体周围。学者已证 实纳米细菌能导致肾小管上皮细胞损伤，诱导细胞与含钙 结晶的黏附，引起肾结石形成。纳米细菌诱导肾小管上 皮细胞损伤过程中出现了细胞凋亡的现象，其中凋亡相关蛋白表达变化及细胞自噬增强可能参与其中。实验采用 纳米细菌刺激人肾小管上皮细胞HK-2的方法，在体外模拟 HK-2损伤的发生，结果发现纳米细菌刺激HK-2细胞24 h 可以上调促凋亡蛋白Bax、下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达， 还能明显诱导线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin、 LC3-I/LC-3II表达。



 

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