抑菌活性相关性研究(一恒DHP-9162使用)

毛茛科金莲花属( Trollius L． ) 植物金莲花( Trollius chinensis Bunge) 为多年生宿根草本植物，其花味苦、 性寒、气芳香，具有清热解毒、止腐愈伤等功效，主治刃 伤、疮殇多脓及咽喉肿痛等。现代药学研究和临 床应用表明，金莲花主要用于上呼吸道感染、咽炎、扁 桃体炎和支气管炎，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤和抗 氧化等活性，并在 2003 年被选为预防严重急性呼吸道 综合征( SARS) 疾病中的复合处方药物之一。由于金 莲花所具有的良好生物活性及广泛应用，使其野生资 源匮乏并遭到破坏，因此急需寻找其替代源药材，以拓 展金莲花药材来源。

1 仪器与材料

B － L 系列分析天平( 梅特勒 － 托利多仪器上海 有限公司) ; HH － S 恒温水浴锅( 江苏金坛县医疗仪器厂) ; 精宏DHP-9162 型电热恒温培养箱( 上海一恒科技有限公司) ; classⅡTYPE B2 无菌操作台( 北京东联哈尔 仪器制造有限公司) ; 超声波清洗器( 昆山市超声仪器有限公司) 。 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、沙门氏菌 和志贺氏痢疾杆菌( 黑龙江中医药大学微生物实验中 心提供) ; 蛋白胨、琼脂粉和氯化钠( 北京奥博星生物 技术有限责任公司) ; 胰酶提取物; 头孢氨苄( 批准文 号: H11020463) ; 金莲花片( 批准文号: Z13020456) 。 昆明种小鼠，体质量( 20 ± 2． 0) g，雌雄各半，清洁 级，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，合格证 号: SYXK 黑 2015001。 短瓣金莲花和金莲花药材采自大兴安岭加格达 奇，经黑龙江中医药大学苏连杰教授鉴定为 Trollius ledebouri Reichb． 和 Trollius chinensis Bunge。 荭草苷和牡荆苷单体自制，经 HPLC 测定纯度为 99． 98% 。

2 方法与结果

2． 1 体外抑菌试验

2． 1． 1 供试品的制备

精密称取干燥至恒重的短瓣金莲花和金莲花， 70% 乙醇回流提取，合并提取液减压回收至无醇味，得 总提取物。上大孔树脂，用水、30% 乙醇、50% 乙醇、 70% 乙醇和 95% 梯度乙醇洗脱，减压回收洗脱液，用 无菌水稀释至相当于生药量 1 g /ml 溶液，并按 2、4、8、 16 倍稀释成 4 个浓度。

2． 1． 2 药敏纸片的制备

用打孔器将普通定性滤纸片用打孔器打成若干直 径为 6 mm 的圆形纸片，置于干燥洁净的小锥形瓶中， 封口，放入高压蒸 气 灭 菌 锅 中，经 121 ℃ 高 压 灭 菌 30 min，放冷，干燥。分别取干燥后的不同供试样品 0． 2 g，用水溶解至浓度为 20 μg /mL，并按倍比稀释法 稀释成 5 个不同的浓度，将滤纸片放入溶剂中，反复吸 取，晾干，直至将溶剂吸干，用紫外灯照射灭菌 10 ～ 15 min，备用。

2． 1． 3 培养基的制备

制备琼脂培养基。精密称取胰酶提物 5 g，蛋白胨 10 g，氯化钠 10 g，向烧杯中依次加入蛋白胨、胰酶提 物、氯化钠，加入 1 000 mL 蒸馏水，将烧杯放在加有石 棉网的电炉上加热，边搅拌边加入 1． 2% 的琼脂粉，加 热至微沸透明。并补足由于蒸发而失掉的水分，用 4% 的 NaOH 调节 pH 值至 7． 2 ～ 7． 4，过滤，均匀分装 于500 mL锥形瓶中，然后放入 121 ℃高压灭菌 30 min， 取出趁热倒入经过高压灭菌的培养皿中，厚度约 3 ～ 5 mm，冷却凝固，备用。

2． 1． 4 菌悬液的制备

分别将菌株先接种于平板，在 37 ℃培养箱中培养 24 h 后，挑选出各个菌株的典型菌落接种于 25 mL 琼 脂培养基中，置 37 ℃培养箱中培养 18 ～ 24 h，取 1 mL 制备菌液用无菌生理盐水( 0． 9% ) 以 10 倍稀释法依 次进行稀释，与麦氏比色管对比，调整其浊度至 0． 5 麦 氏比浊标准( 即 1． 5 × 108 cfu /mL) ，备用。

2． 1． 5 抑菌活性的测定

采用滤纸片扩散法，用无菌移液管吸取稀释好的 菌悬液 0． 1 mL，置于培养皿中央，倒入适量的琼脂培 养液使菌悬液涂布均匀。用无菌镊子夹取含药滤纸片 贴在培养基的表面，同时以含药量为 0． 02 mg /mL 的 头孢氨苄细菌药敏试纸为阳性对照，以无菌双蒸水浸 泡过的滤纸片为阴性对照。将培养基放入 37 ℃ 培养 箱中培养 24 h 后取出观察抑菌圈，并用游标卡尺测量 抑菌圈的大小，结果以毫米( mm) 表示，并以此判断不同浓度供试品对供试菌的抑菌效果，每种不同浓度的 供试品分别做 3 组平行对照，结果取平均值。

3 小结

体外抗菌实验结果表明，短瓣金莲花及金莲花对五种实验细菌均有不同程度的抗菌作用，尤以短瓣金 莲花与金莲花总提取物的抗菌效果最好，荭草苷和牡 荆苷对大肠杆菌及绿脓杆菌抑菌作用比较明显，对其他实验菌作用不明显。推测金莲花属植物抗菌活性可 能与其总黄酮类成分中各单体协同抑菌作用有关。 体内抗菌实验研究表明，与模型组比较，阳性对照 组和金莲花及短瓣金莲花总黄酮 3 个剂量组对感染致 死量的金黄色葡萄球菌小鼠均有一定的体内保护作用 ( P ＜ 0． 05) ，并有一定剂量依赖关系。结果显示，金莲 花与短瓣金莲花的抗菌活性相当。


 

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