2019-12-03 09:51
０ 引言
嗜水气 单 胞 菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）是 一 种条件致病菌，主要存在于海水、淡水、河流、湖泊 等水环境以及污泥、土壤、人类粪便中，是我国淡水 水产养殖鱼类爆发性细菌疾病的主要病原菌，可 以感染草鱼、鲤鱼、鲫鱼以及罗非鱼等多种水产养 殖鱼类．此外，嗜水气单胞菌还可以感染人类，能引 发人类的中耳炎、败血症及创伤面感染、腹膜炎以 及急性肠胃 炎 等 疾 病 的发生 ．在 国 外，嗜 水 气 单 胞菌已经被列入食品卫生检验的对象和医院腹痛 腹泻病原菌检 测 的 一 项 内 容．因 此，嗜 水 气 单 胞 菌 相关疾病的爆发不仅给水产养殖业造成巨大损失， 还直接对人类健康造成威胁，受到水产、医学界的 重视 ．
１ 材料与方法
１．１ 材料与仪器
１．１．１ 中草药原料
黄芩、乌梅、野菊花、凤尾草，四 种 中 草 药 均 购 自西安同仁大药堂．
１．１．２ 受试菌种
嗜水气 单 胞 菌（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）由 本 实验室提供．
１．１．３ 主要试剂与仪器设备
ＬＢ培养 基，１％ＮａＣｌ，１％ 蛋 白 胨，０．５％ 酵 母 粉；碱性磷酸酶试剂盒，购于碧云天生物技术公司． ＨＨ 系列数显恒温水浴锅（金坛市科析仪器有 限公司），ＹＷＦ－３００生 化 培 养 箱（上 海 一 恒 科 学 仪 器有限公司；ＵＶ２９０紫外可见分光光度计（舜宇恒 平有限公司）；ＬＥ２０４Ｅ／０２电子天平（梅 特 勒－托 利 多仪器 上 海 有 限 公 司）；ZX-100 电 热 鼓 风 干 燥 器 （上海一恒科学仪器有限公司）；ＧＴ１０－１高速离心 机（上海精科天美科学仪器有限公司）；ＳＨＢ－３循 环水式多 用 真 空 汞（郑 州 长 城 科 工 贸 有 限 公 司）； ＦＷ－２００高速万能粉碎机（北京中兴伟业仪器有限 公司）；ＬＤＺＸ－５０ＫＢＳ立 式 压 力 蒸 汽 灭 菌 锅（上 海 申安医疗器 械 厂）；ＴＨＺ－Ｃ－１全 温 振 荡 器（太 原 培 英仪器制造有限公司）．
１．２ 实验方法
１．２．１ 嗜水气单胞菌菌悬液的制备
嗜水气单胞菌：在 已 灭 菌 的 含５ ｍＬＬＢ 培 养 基血清瓶中按１％的接种量接种活化后的嗜水气 单胞菌，在恒 温 摇 床 中３０ ℃下 震 荡（２００ｒｐｍ）培 养１３ｈ．采用平板计数法计数，用液体培 养 基 稀 释 菌液至１×１０７ ＣＦＵ／ｍＬ，置４ ℃冰箱中保存备用．
１．２．２ 中草药提取物的制备
分别采用水提法和醇提法对四种中草药 进行提取物原液（１ｍｇ／ｍＬ）的制备．水提 法：以 黄 芩水提物 为 例，称 取 黄 芩 粉 末１０ｇ，加 入１００ ｍＬ 蒸馏水，使料液 比 为１∶１０，浸 泡２ｈ后 超 声 处 理 ３０ｍｉｎ，随后先用武火加热１０ｍｉｎ，再保持文火煎 煮３０ｍｉｎ，四层纱布过滤收集一煎药液，药渣重新 加入１００ｍＬ 蒸馏水，武火加热１０ｍｉｎ，文火煎煮 ３０ｍｉｎ，过滤掉残渣收集二煎药液，合并两 次 药 液后３０００ｒｐｍ 离心１０ｍｉｎ，取其上清液加热浓缩至 １０ｍＬ，调节ｐＨ 值 至７．２，４ ℃保 存 备 用．醇 提 法： 以黄芩醇提物为例，称取黄芩粉末１０ｇ，加入五倍 量的５０％乙醇溶液，料 液 比 为１∶６，浸 泡２４ｈ后 用６０℃恒温水浴锅热浸３ｈ，四层纱布过滤收集药 液，将药渣再加入五倍量的 ５０％乙 醇 溶 液 热 浸３ ｈ，过滤掉残渣，合并两次所得的醇浸液，４５００ｒｐｍ 下离心１０ｍｉｎ取 其 上 清 液，浓缩至原液浓度 为１ ｇ／ｍＬ，调节ｐＨ 值至７．２，４ ℃保存备用．
１．２．３ 不同中草药提取物抑菌活性的测定
采用滤纸片平皿扩散法 ．即取２００μＬ 已活 化好的嗜水气单胞菌悬液，均匀涂布于培养基，将 高压灭菌处理过的滤纸片（直径为６ ｍｍ）浸蘸 不 同中草药提取物原液并紧贴于培养皿表面，每板等 距离放置三 个 做 平 行 实 验，空 白 提 取 物 作 为 对 照 组，置于３０ ℃恒温生化培养箱中培养１２至１８ｈ， 观察是否具 有 透 明 抑 菌 圈，用 游 标 卡 尺 测 量 其 直 径，取平均值，记录数据．
１．２．４ 黄芩提取物最低抑菌浓度的测定
采用二倍稀释法 ．将黄芩提取物原液（１ｇ／ｍＬ） 稀 释 配 成 ５０％、２５％、１２．５％、６．２５％、３．１２５％、 １．５６３％六种浓度梯度．取２００μＬ 已活化的菌悬液 均匀涂布于平板，每个平板等距离放置浸蘸了不同 浓度梯度提取物的滤纸片，根据稀释度从高到低的 顺序，先将６个浓度的药液分为两组，每组是３个 相连的浓度，第 四 个 滤 纸 片 用 无 菌 水 作 空 白 对 照 组，将制作好的培养皿放入４℃冰箱中冷藏３ｈ，待 药液完全扩散到琼脂层后将培其放入３７℃恒温生 化培养箱中 过 夜 培 养１２～１８ｈ，观 察 嗜 水 气 单 胞 菌的生长情况，以确定不同浓度梯度的黄芩水提物 对其的 最 小 抑 菌 浓 度 （Ｍｉｎｉｍｕｍｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｃｏｎ－ ｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ＭＩＣ）记录数据．
１．２．５ 黄芩水提物对嗜水气单胞菌细胞膜的影响
（１）黄芩水提物对菌体培养液电导率的影响 将嗜水气单胞菌活化培养至对数期（４～６ｈ）， 按１％的接种量接种到添加０．５ ＭＩＣ、１ ＭＩＣ 和２ ＭＩＣ黄芩水提物的液体培养基中，置 于 恒 温 摇 床 中培养，以不 加 黄 芩 水 提 物 的 液 体 培 养 基 作 为 空白 对 照，每 隔 两 小 时 取 样，直 至 八 小 时，转 速 为 ３５００ｒｐｍ 下离心１０ｍｉｎ，取上清液用紫外分光光 度计在４５０ｎｍ 波长下测其电导率，实验至少重复 ３次． （２）黄芩水提物对菌体培养液总漏出率的影响 嗜水气单胞菌处理步骤同１．２．５中（１）所述．用 紫外分光光 度 计 在６００ｎｍ 波 长 下 测 上 清 液 的 吸光值，实验至少重复３次
2 结果与讨论
四种不同种类的中草药水提 物对嗜水气单胞菌均具有抑菌作用，抑菌性大小排 序为：黄芩水提物＞野菊花水提物＞乌梅水提物＞ 凤尾草水提物，黄芩水提物抑菌性效果最好．四种不同种类的中草药醇提 物对嗜水气单胞菌也具有一定抑菌作用，抑菌性大 小排序为：黄芩醇提物＞乌梅醇提物＞野菊花醇提 物＝凤尾草醇提物．综上结果可知，所选取的四种中草药 中，黄 芩 提取物原液对嗜水气单胞菌的抑菌效果最为显著， 因此，选取黄芩提取物进行 后 续 ＭＩＣ 的 测 定 及 抑 菌机制的研究．
３ 结论
嗜水气单胞菌作为一种水产养殖的重要病原，不仅直接影响我国水产养殖业的发展，还可以 通过食用水产 品 威 胁 到 人 类 健 康．目 前，对 于 嗜 水 气单胞菌病害的防治主要采用传统抗生素的手段， 但抗生素的长期使用甚至滥用，导致了水产品药物 残留严重超标，长此以往，使得水产养殖病原菌产 生耐药性．
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